[发明专利]一种大肠杆菌的转化方法

说明书

一种大肠杆菌的转化方法，本发明涉及一种微生物菌种的转化方法。本发明解决了现有大肠杆菌转化技术存在的反应时间较长、过程繁琐的问题。本发明方法：首先将质粒与30ul大肠杆菌轻轻混合后放置冰上，然后在42℃水浴中进行热休克，然后马上放回冰中，静置1min；最后接种到含抗生素的固体LB平板培养皿中进行培养。本发明的方法反应时间短、过程简单，利于推广使用。

技术领域

本发明涉及一种微生物菌种的转化方法。

背景技术

目前转化技术已成为重组DNA技术的一项基本操作方法，广泛应用于基因定位、基因克隆、外源基因的表达、基因图谱的绘制等研究中，是分子遗传学的主要研究技术之一。转化的原理是将重组DNA分子导入感受态细胞中进行复制，增殖和表达，以获得目的基因的方法，其原理是质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过短时间的热击处理，促进吸收DNA然后再非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可在含抗菌素的培养基中生长。大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)又称大肠杆菌，因结构简单、遗传背景明确而成为基因克隆实验中最常用的感受态细胞，能够适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，减少克隆DNA同源重组的发生，提高质粒DNA的产量和质量。目前转化的研究不但在理论上有重要意义，而且在基因工程中是将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种重要手段(见重组DNA技术)，它也可能为育种和遗传性疾病的基因治疗提供新的途径。目前转化多应用于载体构建，在细胞水平中应用较为广泛，是目前体外目的基因的分子机制研究重要的前期手段。当前对于大肠杆菌转化技术的优化研究较多，陈向东等先将大肠杆菌活化培养过夜，而后直接将转化混合物直接涂布于4℃下预冷的含Ca²⁺的含抗生素的固体LB平板培养皿上，完成转化。代军将常规的50m L离心管改成了1.5m L EP管，有效降低了分装过程中可能产生的污染风险，简化了试验程序，提高了转化效率。张迹等将42℃热应激优化为室温下放置10min，与LB培养基混合后在恒温摇床培养时间缩短为40min。虽以上研究均对大肠杆菌转化技术进行了不同程度的优化，但反应时间均较长，均需用到LB液体培养基且过程较为繁琐。

发明内容

本发明为了解决现有大肠杆菌转化技术存在的反应时间较长、过程繁琐的问题，而提供了一种大肠杆菌的转化方法。

本发明大肠杆菌的转化方法按照以下步骤进行：先将10μl质粒与30ul大肠杆菌的混合液放置冰上5min，再放入42℃水浴中45s进行热休克，然后马上放回冰中，静置1min；之后再将质粒与大肠杆菌混合液接种到含抗生素的固体LB平板培养皿中，在37℃恒温环境中正放培养1～2h，再倒置放置8～12h，即完成了大肠杆菌的转化。

本发明在转化过程中，大肠杆菌与质粒混合后先低温是为了让DNA-CaCl₂复合体粘着在菌体表面，再经过短暂热激让菌壁通透性改变，又经过1min冰上静置，最后使附着在表面上的DNA进入菌体，即实现了大肠杆菌的转化。在此过程中，本发明仅需要30ul大肠杆菌，且在整个转化过程中无需再进行LB液体培养基进行摇床培养，就可以实现大肠杆菌的转化。本发明的方法反应时间短、过程简单，利于推广使用。

附图说明

图1为实施例1中涂板后图片；

图2是实施例1(本发明优化方法)塑料平皿中菌落生长情况；

图3是实施例1(本发明优化方法)玻璃平皿中菌落生长情况；

图4是实施例2的塑料平皿中菌落生长情况；

图5是实施例2的玻璃平皿中菌落生长情况；

图6为实施例1和实施例2中菌液PCR电泳图；

图7为实施例1和实施例2中双酶切后电泳图。

具体实施方式