[发明专利]一种用于神经系统药物递送的AAV病毒载体

说明书

本发明涉及一种新型AAV载体，该病毒载体包含对应于AAV9的第588位氨基酸位点插入多肽序列WPTSYDA，同时存在H527突变为Y，R533氨基酸突变为S，另外用于表达目的基因的启动子为hSyn，与野生型AAV9载体相比，该AAV9.7YS突变体具有更好的穿透血脑屏障能力，静脉注射该病毒后感染神经系统的能力更强，而对外周组织（心脏、肝脏、骨骼肌）的感染效率更低。本发明还涉及公开的病毒载体的包装制备方法以及在基因治疗中的用途。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于神经系统药物递送的新型AAV病毒。

背景技术

腺相关病毒(AAV)是在人类及其他哺乳动物中发现的一种微小型非致病病毒，AAV包含一个直径约26nm的二十面体衣壳和一个4.7kb的单链DNA基因组。由于其对分裂和非分裂细胞的高效感染性以及特异的体内组织趋向性，重组AAV(rAAV)已被开发为基因传递载体。来自人类及灵长类动物的众多AAV血清型及变体的发现极大的促进了AAV载体的开发，为靶向不同组织及细胞提供了多种选择。

在迄今为止发现的所有AAV血清型中，AAV9因其对肝脏、心脏和骨骼肌的高组织趋向性而在基因治疗应用中广受欢迎，此外，它具有穿越血—脑屏障(BBB)并感染神经细胞的能力，因此被广泛应用于神经系统疾病的基因治疗中。目前基于AAV9，已有诺华公司ZOLGENSMA基因治疗药物获得FDA批准上市，该基因药物采用AAV9携带治疗基因SMN1，用于治疗2岁以下的脊髓性肌肉萎缩症患者，临床试验证据表明，Zolgensma不但能够挽救患者的生命，而且能够让部分患者和健康儿童一样茁壮成长，在接受一次治疗后，Zolgensma的疗效可以维持5年以上，为挽救SMA患者(脊髓肌萎缩症)的生命带来一款可能“一劳永逸”的潜在治愈性疗法。

AAV衣壳蛋白决定AAV具有组织细胞特异性，因此自AAV被证明具有临床应用前景以来，设计新型AAV衣壳以获得新的特征一直是研究人员不断追求的目标。随着技术的进步，开发新的衣壳的策略逐渐演变。目前衣壳蛋白开发策略主要分为合理设计、定向进化以及计算机辅助设计。提高对目标组织细胞的靶向性及高效转导性是AAV基因治疗中减少毒副作用的重要策略，虽然AAV9可穿过血-脑屏障，感染神经细胞，但是其感染效率仍然很低，且静脉注射AAV9病毒后，大量的AAV9病毒会感染心肌、骨骼肌以及肝脏细胞，穿过血脑屏障并感染神经细胞的AAV9病毒所占的比例任然较小，这一现象在国内外多个实验室中得到验证。

因此，本领域急需开发一种能够高效感染神经细胞、低效感染肌肉、心肌以及肝脏细胞且穿越血-脑屏障的能力更强的新型AAV载体。

发明内容

为了解决背景技术中所述的问题。本发明提供了一种能够高效感染神经细胞、低效感染肌肉、心肌以及肝脏细胞且穿越血-脑屏障的能力更强的新型AAV病毒载体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

利用PCR定点插入技术在AAV9衣壳序列，即AAV9野生型衣壳蛋白VP1氨基酸序列SEQ ID NO：2(其中AAV9野生型衣壳蛋白VP1的DNA序列为SEQ ID NO：3)的第558位点后进行特定氨基酸序列SEQ ID NO：4(其中，特定核酸序列为SEQ ID NO：5)的定点插入；然后将插入后的AAV9病毒载体进行转化和质粒的提取，获得序列为的AAV9衣壳蛋白序列，其中氨基酸序列为SEQ ID NO：6，DNA序列为SEQ ID NO：7。

在上述序列的基础上，设计跨越突变位点的定点突变引物，然后利用PCR技术对AAV9衣壳序列上第527和第533位点进行定点突变，在AAV9衣壳蛋白氨基酸的H527突变为Y，R533突变为S，最后对突变后AAV9病毒载体进行转化和质粒的提取，获得定点突变的AAV9衣壳蛋白序列，其中氨基酸序列为SEQ ID NO：8，DNA序列为SEQ ID NO：9。