[发明专利]高活性重组热敏型UDG突变体及其原核表达载体

说明书

本发明提供一种高活性重组热敏型UDG突变体，其特征为：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2或5中任一条所示。还公开了其原核表达载体。本发明在野生型热敏UDG(psychrophilicmarine bacterium)的基础上进行点突变，突变体能够显著提高UDG的热敏性，提高该酶在体外对含U模板的消化能力。通过在载体在N端融合表达SUMO蛋白，该重组蛋白可在大肠杆菌原核表达系统中进行上清表达后经亲和纯化大量获得。能够对qPCR等反应体系有更高的兼容性。其中效果最佳者为UDGm‑1；UDGm‑2；UDGm‑5。

技术领域

本发明专利涉及一种高活性重组热敏型UDG突变体及其原核表达载体，属于生物技术领域。

背景技术

尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil DNA Glycosylase，UDG)能切断DNA中错误插入的尿嘧啶(U)碱基与糖基之间的N-糖苷键，移去尿嘧啶，留下无碱基位点，该位点可被其他酶(如DNA聚合酶和DNA连接酶)识别和修复。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)启动DNA中尿嘧啶的修复,能减少由胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)碱基对向腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)碱基对的颠换率，防止和修复DNA中的错配，是生物体减少突变的自我保护机制之一。

另外，UDG也是防止PCR反应中假阳性的工具酶，UDG在体外通过催化水解含有U-DNA位点DNA链的尿嘧啶糖苷键(碱基切除),释放尿嘧啶并产生碱敏感的无嘧啶基位点(AP-DNA),使含dUTP的核酸不能作为模板被扩增，从而防止PCR反应中由于气溶胶等因素形成假阳性，该酶可作用于含尿嘧啶的单链和双链DNA，对双链DNA的活性低于单链DNA。热敏型UDG通常在较低温度下即可失活，比如，在打断核酸链上的dUTP核苷键后，通过50℃孵育即可失活，可与需要后续进行逆转录反应、qPCR及等温扩增反应等检测联用，提高检测的准确性，简化操作步骤。消除由于含U模板污染等问题而造成的假阳性

目前，常用的热敏型UDG主要来源为嗜冷海洋菌(psychrophilic marinebacterium)，但其较难通过大肠杆菌原核表达系统进行上清表达，且其多种性质不能满足多种与后续qPCR等的联用检测场景。主要存在以下缺陷：

1.嗜冷海洋菌来源的野生型UDG热失活温度高于50℃当与LAMP、RT-LAMP及qPCR等检测中使用时，在完成对本底含U模板消化后，无法在后续反应前完全失活，会对后续反转录及qPCR扩增后的含U目的产物进行持续消化，降低检测体系的灵敏性而造成假阴性。使易对后续反应造成抑制。

2.目前的热敏UDG的比活较低，在同等消化能力下，需投入的酶分子量较高，易对后续体系造成影响，如影响Taq酶的扩增效果或逆转录酶的产量。

3.目前热敏UDG无法通过原核表达系统进行上清表达，经变复性后纯化难度较高，且变复性蛋白无法维持其原本的蛋白结构，对其后续蛋白稳定性造成影响，进一步影响检测体系的稳定性及准确性。

这三个缺陷影响防污染qPCR LAMP及RT-LAMP检测的灵敏度、准确性和稳定性，影响了相关技术的普及和发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种高活性重组热敏型UDG突变体，相比野生型UDG，其热失活温度明显降低。