[发明专利]脱氧核糖核酸酶I活性检测方法

说明书

本发明公开了一种脱氧核糖核酸酶I活性检测方法，其步骤包括以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，利用标准脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，绘制标准曲线；以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，加入待测脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，根据上一步的标准曲线，计算待测脱氧核糖核酸酶I的酶活。本发明通过检测酶解产物的荧光信号来快速测定脱氧核糖核酸酶I的活性，无放射性污染，具有简便、快速、高灵敏等优点，可用于高通量、自动化的聚合酶活筛选。

技术领域

本申请涉及分子生物学领域，具体涉及一种脱氧核糖核酸酶I活性检测方法。

背景技术

脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。脱氧核糖核酸酶I(DNase I)水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。

脱氧核糖核酸酶I(DNase I)活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，脱氧核糖核酸酶I(DNase I)可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，脱氧核糖核酸酶I(DNase I)可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。脱氧核糖核酸酶I不耐高温，在37℃条件下即可进行酶解反应。

脱氧核糖核酸酶I是一种重要的分子生物学工具酶，可用于体外转录后去除模板DNA、RT-PCR和RT-qPCR之前制备无DNA的RNA、与DNA聚合酶I配合，通过缺口平移进行DNA标记、制备不含DNA的RNA、采用DNase I(无RNase)足迹法进行DNA-蛋白相互作用研究等，在基因调控、分子诊断、细胞检测、生物医药等领域有着重要的作用。

由于脱氧核糖核酸酶I应用领域较广泛，因此准确标定脱氧核糖核酸酶I的活性，保证各个批次间活性的稳定，具有重要的意义。传统的脱氧核糖核酸酶I活性测定方法通常采用琼脂糖凝胶电泳法测定酶活，琼脂糖凝胶电泳法其原理主要是：产物经过凝胶电泳后再用放射性标记或染色，最后进行凝胶成像或观察降解效果来分析酶的活性。尽管这种方法已经被广泛使用，但其操作过程复杂，重复性差，只能给出半定量结果；并且染色剂有毒性或放射性，对操作者的健康不利。因此，建立脱氧核糖核酸酶I的快速、灵敏、准确的分析新方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种脱氧核糖核酸酶I活性检测方法，其步骤包括

(1)采用标准脱氧核糖核酸酶I，以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，利用脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，以酶用量为横轴，相对荧光值为纵轴，绘制标准曲线；

(2)以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，加入待测脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，根据步骤(1)获得的标准曲线，计算待测脱氧核糖核酸酶I的酶活。

优选的，所述环状双链DNA为pBR322。

优选的，酶解反应的时间为5-20min，温度为25-37℃。

优选的，终止酶解反应的条件为65-75℃反应10-20min。

Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料，其仅在与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，与酶量呈反比。本发明通过检测酶解产物的荧光信号来快速测定脱氧核糖核酸酶I的活性，无放射性污染，具有简便、快速、高灵敏等优点，可用于高通量、自动化的聚合酶活筛选。本发明方法与原始的半定量的方法比，更精确，操作简单。

附图说明

图1是本发明的原理示意图。