[发明专利]一种简便的基因合成方法

权利要求书

1.一种构建质粒的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

(1)为将目的基因按顺序分割成多个小片段，针对小片段设计上下游引物，其中第一个片段的上游引物的5’端与下游引物的5’端重叠，下游引物的3’端又与第二个片段的上游引物的3’端重叠，第二个片段的上游引物的5’端与第二个片段的下游引物的5’端重叠，第N个片段的上游引物与第N-1个片段的下游引物的3’端重叠，第N个片段的上游引物的5’端与第N个片段的下游引物的5’端重叠，并且第一个片段的上游引物和第N个片段的下游引物的3’端设计有载体两段的同源臂序列；

(2)将步骤(1)中设计的引物混合成混合引物；

(3)将混合引物、第一个片段的上游引物、第N个片段的下游引物和Taq酶混合进行PCR反应得到目的基因；或，将将混合引物和Taq酶混合进行第一轮PCR反应，得到PCR产物，将PCR产物、第一个片段的上游引物、第N个片段的下游引物和Taq酶进行第二轮PCR反应得到目的基因；

(4)将目的基因加入含有镁离子、PEG8000、核酸外切酶和Tris-HCl的反应体系中，反应后转化感受态细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物长度小于等于89bp，所述重叠部分的长度为8～25bp，重叠部分退火温度大于等于60℃，GC含量为24～70％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，引物的工作浓度为10μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR反应体系(a)的反应条件为：98℃3分钟、98℃10秒、68℃3～8分钟、68℃10分钟、12℃10分钟，共35个循环。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR反应体系(b)的第一轮PCR反应条件为：98℃3分钟、98℃10秒、68℃3～8分钟、68℃10分钟、12℃10分钟，共10个循环，第二轮PCR反应条件为：98℃3分钟、98℃10秒、68℃3～8分钟、68℃10分钟、12℃10分钟，共35个循环。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述反应体系中镁离子浓度为0.2～4.0g/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述反应体系中PEG8000的浓度为0～80g/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述核酸外切酶包括但不限于T5核酸外切酶，所述T5的浓度为0.01～0.5μL/mL。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述Tris-HCl的pH为7.0～8.0，Tris-HCl的浓度为1M；浓度为40～140mL/L；优选的，Tris-HCl的pH为7.0、7.5或8.0，浓度为80mL/L。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，在30～48℃下反应10～60min后转化感受态细胞。