[发明专利]一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法

权利要求书

1.一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，包括步骤：

1)唾液蛋白、细胞蛋白或组织蛋白的提取；

2)蛋白多肽和糖肽制备；

3)核心岩藻糖基化糖蛋白富集或支链岩藻糖基化糖蛋白富集；

4)质谱分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述蛋白多肽和糖肽制备包括：

(1)蛋白酶解：

①根据测定浓度取蛋白溶于尿素中，轻微振荡，直至蛋白完全溶解，获得样品；

②向所述样品中加入二硫苏糖醇，孵育；

③向所述样品中加入碘乙酰胺，避光于室温孵育；

④向所述样品中加入二硫苏糖醇，孵育，以淬灭剩余未反应的碘乙酰胺；

⑤向所述样品中加入HPLC水，调节所述样品的pH为8-9；

⑥添加胰蛋白酶，孵育过夜，获得样品溶液；

(2)多肽纯化：

①在所述样品溶液中加入三氟乙酸，直至pH下调至2-3；

②将所述样品溶液加入预先处理的C18萃取柱中，重复操作多次；

③使用三氟乙酸多次清洗所述C18萃取柱；

④在所述样品溶液中加入三氟乙酸，直至pH下调至2-3，重复多次，获得多肽；

⑤将洗出的多肽合并，真空冷冻干燥得到纯化后的多肽样品。

3.根据权利要求2所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于：在步骤(1)的①中，所述蛋白的起始浓度为6-8ug/ul。

4.根据权利要求2所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于：在步骤(1)的⑤中，所述样品中尿素的浓度＜1.6M。

5.根据权利要求2所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于：在步骤(1)的⑥中，所述胰蛋白酶与样品的质量比为1：50-1：100。

6.根据权利要求2所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述核心岩藻糖基化糖蛋白富集包括：获得含岩藻糖糖基化位点的糖肽或富集核心岩藻糖糖基化糖肽两种方式。

7.根据权利要求6所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，所述获得含岩藻糖糖基化位点的糖肽包括：

(a)Endo H和Endo F3酶切：向所述纯化后的多肽样品中加入GlycoBuffer 3缓冲液，再加入糖苷内切酶H和的糖苷酶切酶F3混合酶，孵育过夜，获得混合物；

(b)糖肽氧化和固相结合：

①向所述混合物中加入高碘酸钠避光反应，获得氧化后的样本；

②向所述样本中加入TFA；

③用C18柱子纯化所述样本，获得纯化后的样本；

④取酰肼树脂加入至离心管中，再加入去离子水预处理，去掉过滤液，重复操作两次，获得处理后的酰肼树脂；

⑤将所述纯化后的样本与所述处理后的酰肼树脂反应，获得样品；

(c)岩藻糖苷酶酶切：向所述样品中加入GlycoBuffer 1缓冲液，再加入α1-2,4,6岩藻糖苷酶，孵育，涡旋离心并收集液体，再使用含有TFA的ACN多次洗脱并收集液体，将收集的液体合并，真空冷冻干燥，获得含岩藻糖糖基化位点的糖肽。