[发明专利]CamkB转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法

说明书

本发明公开了CamkB转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法，涉及生物技术领域，针对现有心衰模型的制备成本高，制备效果不理想等问题，现提出如下方案，运用Crisp‑cas9转基因技术，构建CaMKIIδB基因过表达小鼠，再通过他莫昔芬隔天注射，诱导CaMKIIδB基因过表达，1周后小鼠出现射血分数降低的心衰表型。本发明通过使用常规的CRISPR‑Cas9体外转录技术，实现降低容错率的效果同时，提升转录的效率，减低转录的成本，并且相较于常用的TA克隆、限制性酶切克隆及平滑末端克隆等方法存在连接效率低、需要特定限制性酶切位点以及耗时较长等缺点，本发明中采用的In‑Fusion Cloning方法能够将任意DNA片段克隆到任意线性化载体中，在进行PCR反应后，充分确保了目的基因的高保真性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及CamkB转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法。

背景技术

心力衰竭(简称心衰)是由各种原因的初始心肌损伤，引起心脏结构和功能的变化，导致心室充盈或射血能力受损的一种复杂的临床综合征，目前认为慢性心力衰竭发生发展的基本机制是心肌病理性重构，心衰的进展包括两个主要关键过程，一个过程是心肌死亡，另一个则是神经内分泌系统过度激活所致的系统反应，主要与肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统过度兴奋有关，干预这两个关键过程是有效预防和治疗心衰的基础，然而，由于医学伦理的限制，对慢性心力衰竭疾病机制及药效研究需要借助动物模型。

能够广泛应用于慢性心力衰竭疾病机制及药效研究的动物模型应该满足下条件：模型能够反映疾病主要的病理机制、症状、体征；模拟临床疾病的实际发病特点程度高；模拟临床疾病的病变程度可控，且具有良好的重复性；动物遗传背景资料完整；制备模型的方法先进，容易开展；实验动物经济，易于饲养，小鼠等哺乳类动物为制备动物模型的最佳选择。

在结合以上的说明和现有技术制备模型成本高，制备手段容错率低的缺点，通过以小鼠为载体，使用Crisp-cas9体外转录转基因技术以及In-Fusion cloning构建同源重组的方式结合，依靠观察，检测术后模型宏观表征、超声心动指标、组织形态学指标的心衰模型的制备方法刻不容缓，于是现在提出 CamkB转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法。

发明内容

(一)发明目的

为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出CamkB转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法，本发明通过使用常规的CRISPR-Cas9体外转录技术，实现降低容错率的效果同时，提升转录的效率，减低转录的成本，并且相较于常用的TA克隆、限制性酶切克隆及平滑末端克隆等方法存在连接效率低、需要特定限制性酶切位点以及耗时较长等缺点，本发明中采用的 In-Fusion Cloning方法能够将任意DNA片段克隆到任意线性化载体中，在进行PCR反应后，充分确保了目的基因的高保真性。

(二)技术方案

本发明提供了CamkB转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法，有如下步骤：

步骤一：运用Crisp-cas9转基因技术，构建CaMKIIδB基因过表达小鼠；

步骤二：再通过终浓度为20mg/ml的他莫昔芬隔天注射，一共注射5次，注射剂量为50mg/kg，诱导CaMKIIδB基因过表达，1周后小鼠出现射血分数降低的心衰表型。

作为本发明一种优选的方案，根据步骤一和步骤二还有如下详细的操作流程：

1)查询NCBI获得鼠源CaMKⅡδB cDNA序列，通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA，通过构建同源重组的方式，在Rosa26基因位点定点插入CAG-LSLCaMKIIδB-3xHA-IRES-EYFP表达框，将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，经 PCR鉴定小鼠尾巴中基因型，获得CaMKⅡδC条件性过表达小鼠的F0 代；