[发明专利]一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒。该方法基于荧光素酶互补原理用来验证蛋白质相互作用，将Gateway载体技术融合在内构建融合表达载体，利用体外蛋白表达系统翻译迅速得到蛋白溶液，最后用酶联检测分析仪快速检测互作信号。相比烟草瞬转系统，能够更加简单、快速、高效地检测蛋白质之间的互作关系。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测蛋白质互作的检测方法及试剂盒。

背景技术

目前应用于蛋白质互作的检测技术有酵母双杂交技术(Yeast Two Hybrid,Y2H)、GST融合标签的Pull-down技术、Co-IP(免疫共沉淀技术)、荧光共振能量转移技术(FRET)等等。

酵母双杂交系统(Y2H)利用酵母当中一个Gal转录因子的激活作用通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。GST融合标签的Pull-down沉降技术，利用基因重组将带有GST标签的载体插入到目标蛋白A上，谷胱甘肽包裹的磁珠与目标融合蛋白结合，加入细胞裂解液后，具有相互作用的蛋白被融合蛋白吸附的原理，检测蛋白之间的互相作用。免疫共沉淀是基于抗原抗体的反应原理，基于两个蛋白之间会发生相互作用，如果用蛋白A的抗体免疫沉淀A也可能将蛋白B沉淀下来，B的这种免疫沉淀被称为免疫共沉淀。荧光能量共振转移(FRET)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象。可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就会产生FRET现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。

在技术不断发展下，前人根据双分子荧光互补技术的原理，提出了一种新的方法，可以检测两种蛋白的互作情况，称为LCI技术(Huamin Chen,et al.,Firefly LuciferaseComplementation Imaging Assay for Protein-Protein interaction in Plants.PlantPhysiology.2008),当验证两种目标蛋白是否互作时，将荧光素酶分成没有催化作用的两段，一端为N端2～416，为Nluc，另一端为C端398～550，为Cluc，将编码N端片段和C端片段分别克隆重组到不同的表达载体上，然后在N端载体上加上一种目的待测蛋白的基因构成N端验证载体，在C端载体上加上另外一个目标蛋白的基因得到C端验证载体。将N端验证载体和C端验证载体的表达产物混在一起，目标蛋白上融合的报告蛋白不会自发地组装，但是仅当两部分融合蛋白的目的蛋白之间有互作关系时，由于报告基因的两端在空间上距离足够近，因此才能正确组装而发挥荧光素酶的活性，加入其发光底物以后，可以通过相关的仪器来检测其化学发光的有无，若发光，则证明待验证目的蛋白之间存在互作；反之亦然。LCI技术可以利用原生质体表达系统，也可以利用农杆菌介导的瞬时转化表达系统来完成蛋白互作的检验或验证。由于LCI检测的时群体细胞之间的作用，而非单一细胞，所以有效避免了由于单个细胞所造成的假象，排除了细胞自发荧光的干扰。

前期LCI表达载体其多克隆酶切位点单一，当进行蛋白的互作验证时，待测定基因克隆到表达载体有诸多局限性，而且仅仅能应用于2个蛋白之间的互作验证，不便于实现高通量的蛋白质互作筛选。

Gateway技术(Invitrogen):能够克隆一个或多个基因进入到不同的蛋白表达系统，并且大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，去除了冗长的亚克隆步骤，同时还能实现高效的克隆效率。另外，基因在目的载体之间快速简便转移时，还可以保证正确的方向和阅读框，因此Gateway技术被许多研究者应用。