[发明专利]一种适用于发根农杆菌介导的毛状根转化中高效的基因编辑启动子PAtGCS

说明书

本发明公开了一种植物高效启动子P_AtGCS，该启动子的核苷酸序列是序列表1所示的核苷酸序列。研究表明将该启动子插入到pRdCas9载体中驱动Cas9基因表达，通过发根农杆菌介导的毛状根转化，在转基因毛状根中可以高效地进行基因编辑，两条染色体的基因位点同时发生突变比35S启动子驱动Cas9基因编辑载体的效率1.7‑8.3倍。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体是涉及一种来自拟南芥的启动子。

背景技术

CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛应用于动植物突变体的创制和基因的功能研究，而基因编辑效率的高低直接影响研究工作的难易程度和工作效率，影响基因编辑效率的因素包括驱动Cas9和sgRNA表达的启动子、编辑靶点所在基因的位置、编辑受体植物的染色体倍型等。其中研究较多同时也是影响基因编辑效率最大的因素是驱动Cas9基因的启动子，因此选用合适的启动子驱动Cas9的表达在提升基因编辑效率中显得尤为重要。尤其是通过发根农杆菌介导的遗传转化进行基因编辑时，所分析的表型是在产生的转基因毛状根上，大部分的性状只有经编辑的基因产生双突的基因型，才能观察到相应的表型。因此通过发根农杆菌介导的遗传转化进行基因编辑研究基因的功能，基因的编辑效率是关键因素，只有基因编辑效率高、产生的双突类型比例高，才有利于进行基因功能分析。

发明内容

针对上述缺陷，本发明从拟南芥中克隆了一个AtGCS基因启动子，拟南芥AtGCS基因（AT4G23100）编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶（glutamate-cysteine ligase），是催化谷胱甘肽生物合成的第一步和限速步骤，尤其是植物根尖细胞增殖所必需的。在进行植物毛状根转化中，将该启动子驱动Cas9基因的表达进行基因编辑时的效率比35S启动子驱动Cas9基因编辑载体的效率高。

本发明的方案如下：

一种从拟南芥中克隆所得AtGCS基因启动子，最长序列为2411bp，该序列位于拟南芥第4染色体：12109162--12106752的位置，所述AtGCS基因启动子的核苷酸序列如SEQ IDNo.1 所示。

所述AtGCS基因启动子在驱动Cas9基因表达方面的应用。

与现有技术相比，本发明所具备的优势为：

将本发明的启动子驱动Cas9基因的表达，在毛状根转化中获得更高的基因编辑效率，减少了科研工作量，尤其是多基因进行基因编辑更为有效。

附图说明

图1为不同长度的AtGCS基因启动子驱动GUSPlus载体图谱；

图2为大豆毛状根中不同长度AtGCSpro驱动GUSPlus表达，GUS染色结果；

图3为用毛状根转化分析AtGCS启动子在其他双子叶毛状根中的活性；

图4 为pRedU3d-35Cas9载体；

图5为pRdGaCas9载体图谱。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。

实施例一:

（1）AtGCS基因启动子功能分析：