[发明专利]一种泡状棘球蚴原头节提取筛选方法

说明书

本发明属于包虫病研究技术领域，具体公开了一种泡状棘球蚴原头节提取筛选方法，包括以下步骤：(1)分离囊泡组织；(2)初次过滤；(3)初步清洗；(4)二次过滤；(5)筛选。本方法还进一步通过显微镜观察检测原头节的纯度，伊红染色检测镜下拒染头节数量鉴定原头节活性，体外与肝癌细胞共培养检测成囊率。观察结果显示，本发明通过一种泡状棘球蚴原头节提取筛选方法成功实现了从保种沙鼠体内提取筛选纯度高、活性好的原头节，解决了目前获取原头节杂质多、活性参差不一影响进一步基础实验研究的问题。

技术领域

本发明属于包虫病研究技术领域，具体公开了一种泡状棘球蚴原头节提取筛选方法。

背景技术

多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis，E.m)幼虫是泡型包虫病，即泡状棘球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)的病原体，和引起囊型包虫病(cysticechinococcus,CE)的细粒棘球绦虫(E.granulosus,E.g)同属棘球属，是一种可引起人兽共患的病原寄生虫。AE主要流行于北半球，严重危害人类健康及畜牧业发展。AE好发于肝脏，其特征在于寄生虫的持续性、浸润性增殖，逐渐侵入胆管、肝脏周围血管等部位，晚期病灶体积大，并伴有中央坏死腔，可远处转移至肺、脑、肾、肾上腺等器官，在病理学上与缓慢增长的恶性肿瘤多有相似之处，因此本病也被成为“虫癌”。

多房棘球绦虫幼虫独特的增殖潜力基于生发层细胞。它是一种多能成体干细胞，具有广泛的自我更新能力，被认为是唯一的增殖细胞群，驱动寄生虫在宿主体内的生长发育。因此，生发层细胞的获取及培养是当前泡状棘球蚴病体外研究的实验基础，而生发层干细胞的获取需要原头节体外培养成囊泡。2008年Klaus Brehm和Markus Spiliotis发表文献 (DOI:10.1016/j.exppara.2008.03.007)公布了体外培养生发层干细胞的方法，其中提到通过自然沉降的方式(方法A)洗涤原头节，但提取的原头节停留在粗提水平，含囊皮、钙质小体等絮状物多，增加了进一步实验分组时原头节活性不一造成的组间误差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种泡状棘球蚴原头节提取筛选方法，解决了现有技术中提取的原头节杂质多、活性参差不一影响实验进展的问题。

本发明的基础方案为：一种泡状棘球蚴原头节提取筛选方法。步骤包括：

(1)分离囊泡组织：将感染多房棘球蚴6月以上的长爪沙鼠安乐死，置于75％酒精中浸泡15min灭菌消毒备皮，沥干酒精，固定于无菌泡沫板上暴露腹部皮肤，使用无菌眼科剪逐层打开腹腔，无菌镊子钝性分离囊泡组织于盛有无菌PBS的100mm细胞培养皿中清洗，更换培养皿中PBS直至清洗液清亮为止，剔除宿主组织和血液；

(2)初次过滤：将(1)中分离的囊泡组织用无菌手术剪剪碎，采用玻璃组织匀浆器于0℃-4℃条件下研磨，通过匀浆器的玻璃管与柱塞之间微小缝隙和细微的凹陷咬合产生碾切作用，使囊泡破裂原头节释放，缓慢倒入无菌的不锈钢细胞过滤筛中，筛下放置一100mL 编号①烧杯收集滤过物；使用预冷的无菌PBS反复少量多次地加入匀浆器中，将研磨液沿玻璃管嘴倒入细胞过滤筛，细胞过滤筛为100目不锈钢网，细胞过滤筛正向放置于烧杯上使用匀浆器的柱塞底端在筛网中充分搅拌加速过滤进程，余操作同前；

(3)初步清洗：将(2)中烧杯收集所得物沉降3-5min后，去除上清液，烧杯中见大量白色沉淀及絮状物，转移至无菌的50mL离心管中，加入无菌PBS反复清洗、沉降至上清清亮为止，沉淀物含上层絮状物和下层原头节、钙质小体；