[发明专利]一种褐藻胶裂解酶ALyI1及其应用

说明书

本发明从海参肠细菌Tamlanasp.中克隆的褐藻胶裂解酶ALYI1(32.15kDa)。ALYI1，属于多糖裂解酶7家族，该酶在40℃、pH 8.6条件下活性最佳，表现出显著的耐盐性，在0.0–5.0M NaCl之间保持稳定，并对铜绿假单胞菌具有抗生物膜作用，可以作为去除或抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的一种方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶及其应用。

背景技术

绿脓杆菌是一种革兰氏阴性细菌，可引起植物和动物的机会性感染。除了在住院患者中引起医院获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎外，铜绿假单胞菌在呼吸系统受损的囊性纤维化患者中尤其严重。由于铜绿假单胞菌精细的适应机制，包括生物膜形成、对抗生素产生的抗性、基因组可塑性、超突变性以及在感染的不同阶段产生各种毒性阶段，因此在感染后从囊性纤维化患者的肺中根除铜绿假单胞菌非常困难。铜绿假单胞菌的生物膜包含胞外多糖、Pel、Psl和褐藻胶。Pel由N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖组成。Psl由半乳糖和甘露糖组成。

褐藻胶是一种线性酸性多糖，是褐藻(如褐藻科)细胞壁和细胞内物质的重要组成部分。在结构上，它由α-L-古洛糖醛酸盐(G)和β-D-甘露糖醛酸盐(M)组成，通过1，4-糖苷键连接，这两种糖单元可以按照三种模式进行组合:聚古洛糖醛酸(polyG)、聚甘露糖醛酸(polyM)和杂聚物嵌段(poly MG)。

褐藻胶裂解酶具有多种来源，包括海洋和陆地细菌、真菌、病毒、褐藻、海洋软体动物和棘皮动物。在过去的几年里，已经鉴定了许多来自细菌的褐藻胶裂解酶。根据碳水化合物活性酶(CAZy)数据库，已对14个多糖裂解酶(PL)家族(PL5、6、7、8、14、15、17、18、31、32、34、36、39和41)进行了分类，最大的褐藻胶裂解酶家族为PL7家族。

褐藻胶裂解酶是通过β-消除反应降解褐藻胶，产生不饱和产物的酶。按催化方式进行分类，褐藻胶裂解酶可分为内切型和外切型。褐藻胶裂解酶可用于研究褐藻胶的精细结构，生产特定长度的polyM和polyG嵌段或褐藻胶寡糖，用于农业、生物技术和医学工业中的特定应用，以及生产用于生物燃料生产的单糖。褐藻胶裂解酶也被探索作为囊性纤维化的生物治疗剂，因为它们可以通过清除生物膜基质中的褐藻胶来增加抗生素的效率。

本研究从海洋细菌Tamlanasp.I1中分离纯化了一种新的褐藻胶裂解酶。报道了其相关生化特性和对铜绿假单胞菌生物膜的作用能力。该酶具有良好的耐盐性。

发明内容

一方面，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列与SEQIDNo.2相比，具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在一个实施方式中，所述褐藻胶裂解酶来源于海洋细菌Tamlanasp.，例如，海洋细菌Tamlanasp.I1。

在一个实施方式中，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列与SEQIDNo.2相比具有至少99％的序列同一性，并且来源于海洋细菌Tamlanasp.I1。

在优选的实施方式中，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

另一方面，本发明还提供了褐藻胶裂解酶的编码基因，优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

另一方面，本发明还提供了包含上述编码基因的重组载体，所述重组载体优选为重组表达载体，如pET系列的载体，例如pET-22b；又如，pRSFDuet-1载体。

另一方面，本发明还提供了包含上述重组载体的重组菌株，优选的，所述重组菌株为大肠杆菌，如，大肠杆菌BL21。

另一方面，本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在降解褐藻胶中的应用。

在一个实施方式中，所述褐藻胶包括海藻酸钠。