[发明专利]一种重组有机磷水解酶及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种重组有机磷水解酶及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；在本发明中，通过将有机磷水解酶OPH和RNP通过柔性刚性复合连接肽Linker连接，构建出重组有机磷水解酶，记为OPH‑Linker‑RNP；所述重组有机磷水解酶能够在大肠杆菌原核表达系统表达，并且其能够自我高效纯化且耐稳定性好。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组有机磷水解酶及其构建方法和应用。

背景技术

有机磷化合物是人工合成的含磷高毒物质，包括磷酸酯类、磷酸硫醇酯类、膦酸或氨基磷酸酯类、V和G型神经毒剂等，被广泛应用于农药、阻燃剂、增塑剂、化学武器等农业、工业和国防领域。有机磷能够与昆虫和哺乳动物体内的乙酰胆碱酯酶不可逆结合，导致神经系统紊乱，致人死亡。由于自然界对此类化合物的降解能力有限，大量使用的有机磷化合物逐渐积累，造成了严重的食品和环境问题。有机磷水解酶(organic phosphorushydrolase，OPH)是一种将有机磷化合物作为底物的酶，可以高效水解有机磷化合物中的P-O、P-S、P-F和P-CN，并且水解产物是无毒的。因此用OPH来解决环境中有机磷化合物污染问题是一种绿色环保的方法。OPH能安全又彻底去除新鲜蔬菜、瓜果等农产品上残留农药的产品，从根本上不同于市场上的化学洗涤剂采用化工原料用物理方法去除农药残留的方式，也避免了化学洗涤剂去除农药残留不彻底而且会形成二次污染的弊端。

OPH的广泛需求使其成为重要的研究课题。由于从自然界得到的原始OPH常常不具有高活性或热稳定性差，此外分离纯化较为困难，增加生产初始成本，酶活也会有损失的问题。使得有机磷水解酶的实际应用受到限制。微生物的代谢途径多，生长周期短，使得生物降解方式具有降解效率高、条件温和、价格低廉的优点，显示出了较好的应用潜力。而酶在微生物降解有机磷农药的过程中起主要作用，OPH催化醋鍵的断裂，所得的低毒产物可以通过微生物进一步代谢成二氧化碳和水。通过酶法工程开发出耐高温易纯化的的有机磷水解酶成为研究的热点之一。目前，固定化金属离子亲和色谱(IMAC)已成为含组氨酸标签(His-tag)酶的分离纯化和固定化常用的技术。该利用IMAC材料中的过渡金属离子(Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺等)与目标蛋白中组氨酸残基之间的亲和作用，实现His-tag蛋白的分离纯化和固定化。但操作复杂、耗时、效率低，不能增加酶的热稳定，而且制备IMAC的螯合剂会影响金属酶活性。

发明内容

针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种重组有机磷水解酶及其构建方法和应用。在本发明中，通过将有机磷水解酶OPH和树脂素模拟蛋白(Resilin-mimeticprotein，RNP)通过柔性刚性复合连接肽Linker连接，构建出重组有机磷水解酶，记为OPH-Linker-RNP；所述重组有机磷水解酶能够在大肠杆菌原核表达系统表达，并且其能够自我高效纯化且耐稳定性好。

本发明中首先提供了一种重组有机磷水解酶，所述重组有机磷水解酶记为OPH-Linker-RNP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明中还提供了上述重组有机磷水解酶的构建方法，包括：将黄杆菌属(Flavobacterium)的有机磷水解酶与RNP通过接头Linker连接，得到重组有机磷水解酶OPH-Linker-RNP。

其中，重组有机磷水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，对应的核苷酸序列如SEQID NO:4所示；所述RNP(Resilin-mimetic protein，RNP)为12个肽(PSSSYGAPGGGN)的30个重复序列组成的模拟树脂蛋白的人工多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述接头Linker为连接肽GGGGSGGGGSEAAAKEAAAKGGGGSGGGGS，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。