[发明专利]鉴别‘金蕊大红’滇山茶品种的分子特异性标记引物及鉴定方法

权利要求书

1.‘金蕊大红’滇山茶品种的分子特异性标记引物，其特征在于，该特异性标记引物序列如下：

上游引物：5'-TCTTGTGAGGTTAAGAGGGTTT-3'；

下游引物：5'-CTTGGACATTATCATTGGAGCA-3'。

2.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对‘金蕊大红’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于所述方法为：

(1)提取待测滇山茶品种叶片的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的滇山茶品种叶片的基因组DNA作为扩增模板，利用权利要求1所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)对步骤(2)中的扩增产物进行电泳检测，电泳结束后用EB染色，于Tanon凝胶成像仪拍照记录结果，将电泳结果与DL2000Marker进行对比，若条带大小为800bp，则对扩增产物进行DNA双向测序，获得扩增产物DNA序列；

(4)如步骤(3)中所述扩增产物的DNA序列能与NCBI线上数据库的单拷贝核基因成功比对，且所述扩增产物在110bp、308bp、467bp中的至少一个bp上出现特异性位点，则待测滇山茶品种为‘金蕊大红’，反之则否；所述110bp的核苷酸碱基为C，所述308bp的核苷酸碱基为A，所述467bp的核苷酸碱基为A。

3.如权利要求2所述的对‘金蕊大红’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取待测滇山茶品种叶片的基因组DNA的方法为：取待测滇山茶叶片，加液氮磨碎后，以改良CTAB法进行基因组DNA提取。

4.如权利要求2所述的对‘金蕊大红’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增体系，每50μL组成为：25μL Taq混合物；1μL DNA模板；22μL ddH₂O；1μL浓度为10p的上游引物；1μL浓度为10p的下游引物。

5.如权利要求2所述的对‘金蕊大红’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增条件为：在98℃下初始变性2min，再在98℃下变性10s，60℃退火10s，72℃下延伸20s，进行35个循环；最后在72℃下延伸5分钟。

6.如权利要求2所述的对‘金蕊大红’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的电泳检测方法为：取步骤(2)中的扩增产物2μL，与6μL 1×溴酚蓝缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，恒压300V电压下电泳12分钟。

7.如权利要求2所述的对‘金蕊大红’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(3)中所述扩增产物进行DNA双向测序时采用一代3730测序仪。

8.如权利要求2所述的对‘金蕊大红’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(4)中所述单拷贝核基因长度为800bp，在NCBI线上数据库的GenBank登录号为MH257925。