[发明专利]一株表达骨桥蛋白的毕赤酵母菌株

说明书

本发明公开了一株表达骨桥蛋白的毕赤酵母菌株，属于基因工程领域。本发明在毕赤酵母基因组上AOX1位点成功整合包含P_AOX1启动子、α信号肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.1的骨桥蛋白的骨桥蛋白表达框。通过发酵实验发现，本发明提供的毕赤酵母基因工程菌株能够成功表达骨桥蛋白并部分分泌至胞外，但发酵后期蛋白分泌迟滞，大部分蛋白进入液泡。通过Western Blot验证和ELISA定量测定，确定本发明实现了骨桥蛋白的成功表达，且骨桥蛋白的表达量达到32.2mg/L。

技术领域

本发明涉及一株表达骨桥蛋白的毕赤酵母菌株，属于基因工程领域。

背景技术

骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)，亦称唾液酸糖蛋白，是一种高度磷酸化，且具有O-糖基化修饰的酸性蛋白，可由体内多种组织细胞合成或分泌，最早在成骨细胞中被发现，因而最初认为OPN是一种重要的骨基质蛋白，与骨的形成和发展密切相关。而近年的研究发现，OPN在母乳尤其是初乳中的含量甚高，是母乳中非常重要的一类免疫活性蛋白。不同物种间的母乳的OPN的含量存在明显差异，比如，牛乳中OPN的含量约为18mg/L，而人乳中OPN的浓度高达138mg/L。同时，母乳OPN还呈现明显的地区差异性，我国的母乳中的OPN水平显著高于其他国家及地区，且在生命的不同发育时期，OPN的含量也明显不同。有研究指出，在新生儿脐带血血浆、3月龄婴儿血浆中，OPN含量非常高，约为成人的7-10倍，这表明OPN对婴幼儿早期发育具有积极作用，特别是在生命早期的肠道生长、神经系统发育、免疫调节等方面。

胞内OPN和分泌型OPN在免疫调节中均存在重要作用，已经有不少动物研究和随机临床试验来调查母乳OPN对生命早期免疫发育的影响。比如，将OPN注入大鼠真皮质能够诱导高表达OPN受体的巨噬细胞向注射处聚集，且这种局部浸润作用可被抗OPN中和抗体明显抑制。同时，OPN还可以诱导树突状细胞表达人白细胞DR抗原，使得树突状细胞刺激能力增强，亦可通过与CD44和整合素受体的互作来调控树突状细胞从表皮向淋巴结回流。此外，对婴儿(1-6个月)进行随机临床试验，也显示OPN对婴儿免疫具有较好的调节作用。母乳喂养、常规配方奶粉喂养或添加OPN的配方奶粉中含有65或130mg/L OPN(分别为母乳中平均OPN浓度的50％或100％)。与食用常规配方奶粉的婴儿相比，食用添加了OPN的配方奶粉的婴儿的血清TNF-α水平显著降低，患病天数减少。与食用常规配方奶粉的婴儿相比，食用添加OPN配方奶粉的婴儿的免疫细胞特征与母乳喂养的婴儿更相似。在婴儿4个月和6个月时，母乳喂养婴儿和添加OPN配方奶粉婴儿的血浆样本中的OPN水平高于常规配方奶粉婴儿的血浆样本。这些发现表明，在婴儿配方奶粉中添加牛乳OPN可能通过增加内源性OPN合成发挥其有益作用。

目前，市场上OPN的获取方式主要来自新鲜牛乳的提取，使用阴离子交换技术从牛乳清中对OPN进行分离，最终获取的产物中约含有78％的蛋白质，这些蛋白质中近95％为OPN。通过该方法获取的OPN含有灰分、水分和不到1％的脂肪和乳糖。

上述方法获取的OPN是目前市面上销售的唯一的OPN成品，经质谱和功能研究分析发现，这类成品具有高度磷酸化和糖基化。但在牛乳中OPN的含量极低，从1L原料奶中可以提取大约11mg的OPN，按照这样的提取量来计算，约90吨牛乳中才能提取1公斤的OPN。因此，通过新鲜牛乳提取很难实现OPN的大规模市场化，且成本高昂。

发明内容

人源蛋白的大量表达，需经过表达后的修饰加工和糖基化，大部分菌种没有类似功能，本发明所要解决的技术问题是成功将骨桥蛋白在毕赤酵母中表达并正确修饰加工，同时能够快速的分泌到细胞外，实现增强骨桥蛋白的高效表达。

本发明的第一个目的是提供一种毕赤酵母基因工程菌，所述毕赤酵母基因工程菌基因组上整合有表达盒，所述表达盒包含P_AOX1启动子、α信号肽和骨桥蛋白。