[发明专利]一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织提取方法及其应用

权利要求书

1.一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：(1)用70-80％酒精擦拭牛皮肤表面，然后采集牛背最长肌肌肉组织，立即放入35-38℃的磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，每次25-30s，并置于35-38℃的磷酸盐缓冲液浸润；(2)将所述牛背最长肌肌肉组织表面筋膜、白膜剔除干净；(3)其次将所述牛背最长肌肌肉组织使用三蒸水中漂洗至少一次，再置于磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，接着在70-80％酒精中漂洗15-20s，接着在磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次得所述牛肌肉组织。

2.一种分离牛肌肉干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)按照权利要求1所述的肌肉组织提取方法提取牛肌肉组织，然后切成碎粒，再用35-38℃的磷酸盐缓冲液重悬、洗涤碎粒组织血丝，37℃恒温静置5min，去上清；(b)将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液；(c)将所述牛肌肉组织消化液分别使用70μm，40μm过滤器过滤组织液，离心收集细胞沉淀，并加入37℃磷酸盐缓冲液洗涤细胞以致进一步除去血丝，再次离心收集细胞沉淀得原代牛肌肉干细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述牛背最长肌肌肉组织来自胎牛。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胎牛为3-4月龄胎牛。

5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液，分成两步法进行：第一步，在胶原酶溶液中添加中性酶Ⅱ，37℃、无菌摇床环境摇动消化；第二步，弃除胶原酶溶液，加入0.25％胰酶溶液，重悬混匀，37℃、无菌摇床环境摇动消化。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述原代牛肌肉干细胞进行原代培养，包括：

将所述原代牛肌肉干细胞混匀、静置2h，再将上层细胞液继续培养，静置1-1.5h，再转移上层细胞液继续培养；在两次培养过程中，使用原代培养基，所述原代培养基包括：糖分含量为0.5-1.5g/L DMEM基础培养基，19-21nM两性霉素,0.62-0.63mg/mL庆大霉素，95-105μl/mL青链霉素，胎牛血清，其体积比为39-40mL：0.1-1：0.1-1：0.1-1：9-11。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述原代培养后进行传代培养，包括：使用牛肌肉干细胞普通培养基进行培养，所述牛肌肉干细胞普通培养基包括：含量为0.5-1.5g/L DMEM基础培养基，95-105μl/mL青链霉素，胎牛血清，其体积比为：44-45：0.1-1：4-6。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述传代培养结束后的牛肌肉干细胞使用磷酸盐缓冲液洗涤，然后使用成肌分化诱导培养基进行培养诱导所述牛肌肉干细胞成肌；所述成肌分化诱导培养基包括：糖分含量0.5-1.5g/L的DMEM基础培养基，95-105μl/mL青链霉素，马血清，其体积比为48-49:0.1-1：0.5-1.5。

9.一种牛肌肉干细胞超级增强子的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：(I)根据权利要求2-8任一所述的方法获得所述牛肌肉干细胞；(II)对所述肌肉干细胞进行染色质免疫共沉淀高通量测序，获得全基因组中不同染色体上构成增强子标记；(III)依次使用H3K4me1 BED文件和H3K27ac BAM文件的ROSE算法进行肌肉干细胞超级增强子鉴定，并对12.5kb范围内的H3K4me1结合峰进行缝合，获得构成增强子，之后通过H3K27ac BAM文件计算每个构成增强子内的信号值，并基于H3K27ac信号值对构成增强子进行排序，获得所述牛肌肉干细胞超级增强子。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述染色质免疫共沉淀高通量测序的数据进行质控，综合reads读数数量、NSC值、RSC值及NRF值进行评价；选择TSS及前后2K区域内存在reads读数；NSC1.10，RSC1.0；NRF0.7的数据。