[发明专利]油包菌数字PCR检测霍乱弧菌活的非可培养细胞的方法

说明书

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及油包菌数字PCR检测霍乱弧菌活的非可培养细胞的方法。所述方法包括：针对经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本，采用PBS洗涤1~3次，采用热裂解释放DNA后进行PCR检测；根据检测结果判断VBNC状态霍乱弧菌的数量；所述热裂解法包括：在PCR循环开始的预变性步骤添加92~98℃，10~15分钟的处理步骤，以及4~37℃，10~15分钟的冷处理步骤。本发明通过油包菌数字PCR对霍乱弧菌的VBNC状态进行检测和绝对定量，可以准确、快速地检测出VBNC状态霍乱弧菌细胞的数量，这对于霍乱弧菌的VNBC细胞的检测有重要意义。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及油包菌数字PCR检测霍乱弧菌活的非可培养细胞的方法。

背景技术

活的非可培养状态（以下简称VBNC）状态细菌是一类具有某些生物学活性，但不能用常规的培养方法使其生长繁殖和形成菌落的细菌，其生物学活性可通过测定核酸、酶、呼吸或蛋白质等指标检测出来。

现有的水体和土壤环境中，存在大量VBNC状态细菌，包括有弧菌属、沙门氏菌属、气单胞菌属、螺杆菌属、军团菌属、葡萄球菌属、弯曲菌属、志贺氏菌属和埃希氏菌属等，其中包括多种病原菌，这对公共卫生健康带来巨大威胁。因此定量检测水环境中VBNC细胞和死细胞对于水环境微生物研究、疾病监测和控制是非常重要的。但是传统用于染色法和显微镜观察法无法准确定量VBNC细胞。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种油包菌数字PCR检测霍乱弧菌活的非可培养细胞的方法，通过PBS洗涤热裂解释放DNA，有效提高检测VBNC状态霍乱弧菌的准确率。

第一方面，本发明提供一种油包菌数字PCR检测VBNC状态霍乱弧菌的方法，包括：

针对经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本，采用PBS洗涤1~3次，采用热裂解释放DNA后进行PCR检测；根据检测结果判断VBNC状态霍乱弧菌的数量；

所述热裂解法包括：在PCR循环开始的预变性步骤添加92~98℃，10~15分钟的处理步骤，以及4~37℃，10~15分钟的冷处理步骤。

进一步地，所述PCR检测的对象为thyA，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述PCR检测中所用引物对为：

thyA正向引物：5'-ACATGGGACGCGTGTATGG-3'，

thyA反向引物：5'- ATATGACCACCATCAGGCTTAGC -3'。

进一步地，所述PCR检测为qPCR或ddPCR检测。

进一步地，所述qPCR的反应程序为：95°C ，10min；95℃，5 s；54℃，30s循环40次；所述ddPCR的反应程序为：

95°C，10 min；95°C，30 s和54°C，30 s的40个循环；4℃，5min，90℃，5min。

进一步地，所述qPCR的热裂解步骤为：

在PCR循环开始的预变性步骤添加92~98℃ 10~15分钟的处理步骤，以及37℃ 10~15分钟的冷处理步骤；和/或，

所述ddPCR的热裂解步骤为：

在PCR循环开始的预变性步骤添加92~98℃ 10~15分钟的处理步骤，以及4℃ 10~15分钟的冷处理步骤。

进一步地，所述PMA处理包括如下流程：

将所述待检测霍乱弧菌样本置于4℃条件下，采用20~30mM的PMA处理20~30分钟，然后采用卤素灯在冰上照射15~25分钟。

本发明进一步提供所述方法在定量检测水环境中VNBC状态的霍乱弧菌中的应用。

本发明具备如下有益效果：