[发明专利]一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法

权利要求书

1.一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)检测样品对细胞活性的影响，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品；

(2)将对数生长期的细胞接种于6孔板中，在37℃和5％CO₂饱和湿度环境下孵育18～24h；

(3)将6孔板中的细胞按照6孔板的孔数分为样品处理组、阳性对照组和空白对照组，在样品处理组中更换含有待测样品的培养基；在阳性对照组中更换含有标准美白成分的培养基，将上述样品处理组、阳性处理组和空白处理组置于培养箱中孵育24～72h；

(4)将步骤(3)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别弃去上清液后，用胰酶消化制成单细胞悬液，再离心，沉淀用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞后计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致；

(5)将步骤(4)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别进行离心处理，沉淀分别用裂解液处理后，于75～85℃的条件下孵育20～40min，用酶标仪分别测定波长475nm下样品处理组、阳性对照组和空白对照组的吸光度，并计算细胞中黑色素的含量。

2.根据权利要求1所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，所述步骤(2)操作如下，将对数生长期的细胞接种于6孔板中，先在37℃和5％CO₂饱和湿度环境下孵育4～6h，更换含有茶碱的培养基继续培养14～18小时。

3.根据权利要求2所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，含有茶碱的培养基中茶碱的添加量为0.8～1mM。

4.根据权利要求3所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述含有待测样品的培养基为含10％胎牛血清的基础培养基，并添加有待测样品和浓度为0.8～1mM的茶碱；

所述含有标准美白成分的培养基为含10％胎牛血清的基础培养基，并添加有标准美白成分和浓度为0.8～1mM的茶碱；

所述标准美白成分为熊果苷，所述标准美白成分的浓度和待测样品的浓度相同。

5.根据权利要求1所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，所述步骤(1)中检测样品对细胞活性的影响的操作方法如下：将对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔4×10⁴个，37℃和5％CO₂的饱和湿度环境下孵育24h，加入梯度浓度的样品分别处理48h，利用MTT法检测细胞存活率，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品。

6.根据权利要求5所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，所述MTT法的操作方法如下：弃去96孔板内培养基，每孔加0.4mg/mL MTT溶液100μL，在培养箱中孵育1-3h后，吸去上清，每孔加150μL二甲基亚砜，振荡后用酶标仪分别测定波长为550nm和650nm下的吸光度，计算细胞存活率，得到细胞的存活率≥75％的浓度。

7.根据权利要求1所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，所述细胞为小鼠皮肤黑色素瘤细胞。

8.根据权利要求1所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，所述裂解液为1mol/L的氢氧化钠溶液，且所述氢氧化钠溶液中含有10％二甲基亚砜。

9.根据权利要求1所述的精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，所述美白产品为具有美白效果的原料、提取物和组合物中的任意一种。