[发明专利]一种棉酚降解酶CCE001a基因、氨基酸序列及其应用

说明书

本发明公开了一种棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因，其基因的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因在棉酚降解中的应用。本发明采用上述的一种棉酚降解酶CCE001a基因、氨基酸序列及其应用，蛋白可有效降低棉酚的含量，并有效促进棉酚的小分子衍生物的产生，也可以和蛋白质的氨基酸结合形成大分子物质，从而达到棉酚脱毒的目的。这将在生产实践中产生重要价值，提高棉籽粕在饲料配方中的用量。

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其是涉及农业生物技术领域，具体是涉及一种棉酚降解酶CCE001a基因、氨基酸序列及其应用。

背景技术

棉花是中国非常重要的农作物，尤其是在占种植面积80％以上的新疆地区。棉花秸秆内含有大量的粗纤维、维生素B和有机磷，常被用于反刍动物饲料，但棉纤维和棉花中含有有毒酚类化合物棉酚。

棉酚是一种来自棉花的多酚有毒植物次生代谢物。在共同进化关系下，棉酚对攻击寄主植物的食草昆虫起着重要的防御作用，并且，宿主生物体还可以产生解毒剂(酶)来减弱或抵消这种毒性作用。

目前，常见的棉酚脱毒方法是通过棉籽机械处理，再使用正己烷溶液低温提取，溶解棉花色素腺中的棉酚，使得棉酚含量降低至200mg/kg。但是，这些方法还降低了饲料原料的蛋白质质量、维生素含量和饲料适口性。

微生物发酵进行棉籽粕脱毒也是常用的一种方法，可以降低棉酚毒性并增加一些未知的活性分子。但是，微生物发酵的菌种中念珠菌、曲霉、米根霉、鲁氏毛霉等，这些真菌发酵的中间体会对单胃动物生长、发育和繁殖等方面产生明显的不良影响。

目前，尚无从酶学角度研究棉粕生物酶解脱毒方法。由于棉酚降解酶难以分离纯化得到，因而其酶类属性、酶蛋白特性、相关基因以及棉酚降解的途径等研究滞后，无法从微生物棉酚降解酶基因异源高效表达获得目标酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种棉酚降解酶CCE001a基因、氨基酸序列及其应用，蛋白可有效降低棉酚的含量，并有效促进棉酚的小分子衍生物的产生，也可以和蛋白质的氨基酸结合形成大分子物质，从而达到棉酚脱毒的目的。这将在生产实践中产生重要价值，提高棉籽粕在饲料配方中的用量。

为实现上述目的，本发明提供了一种棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因，其基因的序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因在棉酚降解中的应用。

一种棉铃虫羧酸酯酶CCE001a，其氨基酸序列包括556个氨基酸，且为如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，其理论分子量为68.7kD。

一种具有棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因的重组载体，所述载体为pPICZαA质粒载体，所述基因表达重组载体为pPICZαA-CCE001a-2A-αsignalfactor重组载体。

一种具有羧酸酯酶水解酶基因CCE001a的重组载体，优选为pMD19-CCE001a。将CCE001a基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。

优选的，将棉酚降解酶基因插入到质粒pPICZαA上的ECORⅠ和XbalⅠ限制性酶切位点之间，将重组载体导入毕赤酵母GS115中，使得GS115表达pPICZαA-CCE001a。

一种具有棉铃虫羧酸酯酶CCE001a基因重组载体的制备方法，步骤如下：

S1、获得棉铃虫CCE001a基因的CDS编码区序列，标记其起始密码子编码序列ATG和终止密码子编码序列TGA；

S2、选取包含CDS区的一段碱基序列，设计引物；

所设计的引物为：