[发明专利]一种淀粉降解能力提高的嗜热酸性III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种淀粉降解能力提高的嗜热酸性III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程领域。对嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK‑PUL中进化偶联氨基酸残基对K526/L538进行饱和突变，构建相应的饱和突变体文库，通过比较各突变体对可溶性淀粉的酶活力，筛选出针对可溶性淀粉的比酶活力显著提高的III型普鲁兰水解酶突变体Mut(K526N/L538E)。本发明提供的III型普鲁兰水解酶突变体Mut对可溶性淀粉的酶活力由对照(突变前)的54.08U/mg提高到190.47U/mg，提高了2.52倍，更适用于淀粉酶法制糖工业，有利于简化工艺、节约能源。

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，特别是涉及一种淀粉降解能力提高的嗜热酸性III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

淀粉糖是以农产品中淀粉含量较高的农作物为原料，运用液化、糖化、转苷、脱色以及离子交换等生物技术手段精制生产的不同种类的糖品。淀粉糖消费领域广、数量大，是淀粉深加工的支柱产品。我国的淀粉制糖工业发展迅速，淀粉糖的产量、种类、质量、规模都处于较高水平，其中产量仅次于美国，居世界第二位。因此，优化淀粉制糖工艺的相关研究对于我国淀粉制糖工业的进一步发展具有重要的技术和经济意义。

现行淀粉制糖工艺包括液化和糖化两个步骤。由液化转入糖化时需要降低温度并加酸降低糖浆的pH，并且糖化过程中使用了多种水解酶。这些因素使得淀粉制糖的工艺复杂、能耗大、生产成本增加，同时降低了生产效率。若某种淀粉水解酶能够以单酶在液化条件下同时进行液化和糖化两个步骤，则可以省去多种淀粉水解酶的应用以及调节温度、pH的过程以简化工艺、降低成本，并且在液化的高温下还可以获得较高的反应速率。因此，人们希望能够获得一种在液化条件下有效水解淀粉为淀粉糖的淀粉水解酶。

嗜热酸性III型普鲁兰水解酶能够水解淀粉中α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键，在高温的液化条件下，且在无其他淀粉水解酶辅助的情况下完全水解淀粉为淀粉糖，使淀粉酶法制糖工业的液化过程和糖化过程合二为一，从而大大降低生产成本，提高生产效率。目前已知酶活力最高的嗜热酸性III型普鲁兰水解酶是来源于嗜热古生菌Thermococcuskodakarensis的TK-PUL(Ahmad N,Rashid N,Haider M S,et al.Novel maltotriose-hydrolyzing thermoacidophilic type III pullulan hydrolase from Thermococcuskodakarensis[J].Applied and Environmental Microbiology,2014,80(3):1108-1114.)。TK-PUL的酶学性质完全适用于淀粉酶法制糖工业，可以单独完全水解淀粉为淀粉糖。但是TK-PUL的催化活性尚不能满足淀粉酶法制糖工业的需求，这限制了TK-PUL在淀粉酶法制糖工业中的应用。

发明内容

为解决嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL的催化活性不能满足淀粉酶法制糖工艺的需求的问题，本发明的目的是提供一种淀粉降解能力提高的嗜热酸性III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：