[发明专利]Msn2p作为负调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用

说明书

本发明涉及真核基因表达的转录调控因子的应用，特别是涉及一种组成型启动子Pgap的转录调控因子Msn2p的应用。本发明公开了Msn2p作为负调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用，所述Msn2p的氨基酸序列是由核苷酸序列为SEQ ID NO:1的Msn2基因所编码的；所述应用为通过敲除Msn2基因从而提高宿主细胞中蛋白的表达。本发明所述的应用能通过减少阻遏作用来增强毕赤酵母表达系统中组成型启动子Pgap转录调控，进而提高目的蛋白的表达效率和产量。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物工程学领域，涉及真核基因表达的转录调控因子的应用，特别是涉及一种组成型启动子Pgap的转录调控因子Msn2p的应用。

背景技术

启动子是调控基因表达的最重要元件之一，P_AOX1启动子（诱导型）和Pgap启动子（组成型）是毕赤酵母外源蛋白表达中最具代表性的启动子。

甲醇诱导毕赤酵母表达系统是目前用于表达大多数异源蛋白常用的表达系统，然而并不是所有的外源蛋白均适合甲醇诱导表达而且甲醇在大规模生产时存在极大的安全隐患。相对甲醇诱导，组成型毕赤酵母表达系统表达异源蛋白时不使用甲醇诱导，但是大多数的组成型启动子强度相对较弱，无法获得较高的蛋白产量，致使其在应用上受限制。

针对甲醇诱导的弊端，近年来对毕赤酵母表达系统的优化改造成为了研究热点。在启动子的改造研究上，目前主要是通过各种方法构建新的启动子文库。其中，有不少研究通过在PAOX1上删除或插入顺式作用元件、对5'UTR或核心启动子区域进行点突变等来改造PAOX1从而导致PAOX1的激活，但是这些改造似乎不能很好地消除由高水平葡萄糖和甘油等替代碳源引起的抑制，且远达不到工业应用的水平。对于Pgap文库的构建，唯一的研究是Qin等通过易错PCR进行随机突变构建GAP启动子文库，但是方法随机，无法解释Pgap的调控。随着转录组数据分析的应用，启动子开发工作得到很大的提升。关于调控和提高PAOX1的表达强度相关研究已有很多报道，目前研究表明，甲醇可通过调控多个反式作用元件（主要集中于PAOX1启动子的转录调控因子或者碳源阻遏相关转录因子等）的活性或亚细胞定位，在转录水平调控PAOX1，从而影响甲醇代谢通路相关基因的表达。尽管如此，参与PAOX1调控的机制复杂，部分碳源的去阻遏，在蛋白表达上并未能超越传统的甲醇诱导。目前在启动子调控的研究上主要集中于PAOX1，而对于探索Pgap的转录调控的研究，目前只有OzgeAta等，通过有针对性地删除或复制转录因子结合位点（TFBS），构建启动子变异体的高表达rhGH菌株，而在公开文献中报道通过对Pgap启动子的转录调控的改进，来增强Pgap启动子表达目的蛋白产量的报道几乎是空白的。

根据文献报道，转录因子Msn2p通过激活酿酒酵母中的应激反应基因的转录，在响应环境胁迫中起关键作用。Msn2p在毕赤酵母中推定为PAS_chr2-1_0723（序列号为：NC_012964.1），而目前尚未有报道提及其对Pgap的转录调控。

发明内容

本发明的主要目的是针对宿主细胞中异源蛋白表达存在的问题和不足，提供了一种调控宿主细胞中异源蛋白表达的转录因子Msn2p，能通过减少阻遏作用来增强毕赤酵母表达系统中组成型启动子Pgap转录调控，进而提高目的蛋白的表达效率和产量。

本发明的第一个方面，提供了Msn2p作为负调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用，所述Msn2p的氨基酸序列是由核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的 Msn2基因所编码的；所述应用为通过敲除 Msn2基因从而提高宿主细胞中蛋白的表达。

根据本发明所述的应用，所述宿主细胞是选自：毕赤酵母、酿酒酵母、产甘油假丝酵母。

根据已有文献报道，毕赤酵母、酿酒酵母、产甘油假丝酵母等均可以接受以Pgap为启动子的酵母表达载体，用以表达异源蛋白，因此可作为本发明的宿主细胞。