[发明专利]一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用

权利要求书

1.一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合，其特征在于,包括PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-15；

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数；

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：

荧光探针和荧光染料；

1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析；

2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2.一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合应用，其特征在于，包括以下应用方法：

内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成，上游引物用荧光标记，下游引物不标记，在模板扩增的同时，内标也被扩增，在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板；

竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板，在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记），扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数；

PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色，常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

3.一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合试剂盒，其特征在于，包括缓冲液10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间。

4.根据权利要求3所述的一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用，其特征在于：所述0.1mol/LTris-Cl(1000mL)，Tris碱12.11g，ddH2O800mL，HCl49mL，三者混匀充分溶解后,滴加浓盐酸调pH至8.0,定溶至1000mL。

5.根据权利要求3所述的一种检测宫颈细胞基因甲基化的核酸组合及试剂盒与应用，其特征在于：所述0.01mol/LTris-Cl(1000mL)，Tris碱1.211g，ddH2O800mL，HCl49mL，三者混匀充分溶解后,滴加浓盐酸调pH至8.0,定溶至1000mL。