[发明专利]一种特异识别微囊藻毒素的双链DNA功能化整体柱

权利要求书

1.一种特异识别微囊藻毒素的双链DNA功能化整体柱，其特征在于：以微囊藻毒素适配体与带有荧光标记的互补寡核酸链杂交生成双链DNA修饰有机-无机杂化整体柱，制备特异识别微囊藻毒素的亲和整体柱，与微囊藻毒素MC-LR发生管内特异识别，释放荧光标记的DNA互补链，实现MC-LR毛细管柱上激光诱导荧光高灵敏分析。

2.根据权利要求1所述的特异识别微囊藻毒素的双链DNA功能化整体柱，其特征在于：所述的亲和整体柱是由适配体与带有荧光标记的互补寡核酸链杂交生成双链DNA修饰有机-无机杂化整体柱所得；所述的有机-无机杂化整体柱是以低聚倍半硅氧烷为聚合单体和含多烯烃基团的丙烯酸酯为交联剂、以惰性溶剂为致孔剂、经光引发剂在紫外光照射下聚合而成；所述的聚倍半硅氧烷为聚八甲基丙烯酸酯基笼型倍半硅氧烷，n=8-12，所述的交联剂为季戊四醇三丙烯酸酯，所述的致孔剂为甲醇、N-N-二甲基甲酰胺组成的二元混合溶液，所述的光引发剂为2,2-二羟甲基丙酸。

3.根据权利要求1所述的一种特异识别微囊藻毒素的双链DNA功能化整体柱，其特征在于：所述的有机-无机杂化整体柱，按聚合单体、交联剂和致孔剂三者质量百分数之和为100%计，甲基丙烯酸酯异丁基聚倍半硅氧烷占比2.7%~4.5%，季戊四醇三丙烯酸酯占比11.2%~16.0%，甲醇占比64.0%~69.7%，N-N-二甲基甲酰胺占比12.3%~17.2%；所述的光引发剂2,2-二羟甲基丙酸的比例为聚合组成总质量的2.5%。

4.根据权利要求1所述的一种特异识别微囊藻毒素的双链DNA功能化整体柱，其特征在于：所述的核酸适配体为5'-SH-C₆-GGCGCCAAACAGGACCACCAT GACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3'；荧光标记的寡核酸链序列为5'-FAM-CATAAT GAGGTGGTATGGGTAATTGTCAT-3'。

5.根据权利要求1所述的特异识别微囊藻毒素的双链DNA功能化整体柱的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包含以下步骤：

（1）按比例准确称取甲基丙烯酸酯异丁基聚倍半硅氧烷、季戊四醇三丙烯酸酯、甲醇、N-N-二甲基甲酰胺以及2,2-二羟甲基丙酸，涡旋振荡至完全溶解后，快速振荡并超声，迅速将所得溶液注入到表面烯基化的透明石英毛细管中，两端封口后于紫外光下聚合7 min；随后以甲醇为流动相冲洗整体柱0.5 h，得到表面富含烯基双键的有机-无机杂化聚合整体柱；

（2）将MC-LR适配体及荧光探针标记的碱基互补链分别放置于两个锥形离心管中，10000 r/min离心10 min，然后加入pH =7.50含有500 mmol/L NaCl的10 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）进行溶解稀释，置于90℃水浴中加热10 min，迅速冷却至0℃后形成浓度为100mmol/L 的核酸适配体和荧光探针标记的碱基互补链储备溶液；将适配体与修饰荧光基团的互补链按照体积比1：1的比例等摩尔浓度混合，并加入40μL pH =7.50含有500 mmol/LNaCl的10 mmol/L PBS缓冲盐，放置于孵育器中55℃孵育2小时，得到抗MC-LR的适配体与碱基互补链结合组成的双链DNA；

（3）取得到的所需抗MC-LR的双链DNA溶液20 mL，注入步骤（2）的基质整体柱中，在pH =7.50含有500 mmol/L NaCl的10 mmol/L PBS缓冲液60℃水浴反应1小时，制得表面键合有MC-LR的适配体与碱基互补链的有机-无机杂化聚合亲和整体柱，于4℃下保存。

6.根据权利要求1所述的特异识别微囊藻毒素的双链DNA功能化整体柱在检测微囊藻毒素中的应用，其特征在于：按照体积比1:1将20 mL含MC-LR待测物加入pH =7.50含有500mmol/L NaCl的10 mmol/L PBS缓冲溶液，取20 mL注射进入制备的亲和整体柱，洗脱溶液进入柱后空管窗口，采用激光诱导荧光检测柱上测定MC-LR；所述激光诱导荧光的激发波长为492 nm，发射波长为518 nm。