[发明专利]一种ω-转氨酶突变体及其在制备西塞卡纳药物中间体的应用

说明书

本发明公开了一种ω‑转氨酶突变体及其在制备西塞卡纳药物中间体的应用，涉及分子生物学技术领域。一种ω‑转氨酶突变体，由来自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω‑转氨酶突变所得，野生型ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ω‑转氨酶突变体的突变位点为：V149A/R128L/L182V/D224K、V149A/R128L/L182F/D224K或V149A/L182F/L187F/D224K中的至少一种。本发明基于一种催化口袋疏水氨基酸的位阻效应，确定需要突变的氨基酸残基位点，结合高通量显色的定量筛选方法，通过定点突变技术进行实验验证，该方法可有效地提高突变氨基酸位点的筛选概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性、酶活性明显优于野生酶的突变酶。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种ω-转氨酶突变体及其在制备西塞卡纳药物中间体的应用。

背景技术

手性胺由于其高密度的氢键的形成和精细的生物活性，逐渐成为许多医药领域的关键组成部分药物。手性胺经常用于合成手性药物，如阿尔茨海默病药物卡巴拉汀、肾上腺素能拮抗剂地来洛尔、抗逆转录病毒药物洛匹那韦、糖尿病药物西他列汀等。这些手性化合物的应用药物极大地促进了高效合成药物的探索手性胺。

(R)-1-(1-萘基)乙胺(R-NEA)是一种重要的手性芳香胺，是重要的医药中间体和中间体手性拆分剂。例如，R-NEA和3-(3-三氟甲基苯基)-丙酸可以进行酰胺偶联用于生产拟钙剂盐酸西那卡塞用于治疗与甲状旁腺癌相关的继发性甲状旁腺功能亢进和高钙血症。此外，(R)-和(S)-1-(1-萘基)乙胺可吸附在聚结晶铂表面，制备高活性手性催化剂。与传统的化学合成方法相比，生物催化是光活性胺合成的绿色替代方法。生物催化剂通常在环境温度和中性pH下运行在水介质中，催化手性中间体的生物合成高效可行的方式。在过去几十年里，各种已经探索了用于手性胺合成的酶，如胺脱氢酶、单胺氧化酶、还原性氨基酶、亚胺还原酶、氨解酶和转氨酶。

转氨酶是催化某基团从供体化合物转移到受体化合物上的一类酶，可以通过简单的催化剂里，可逆地将来源于氨基酸供体的氨基转移到氨基酸受体上。目前，在不对称合成手性胺类化合物及胺类化合物外消旋体拆分中，转氨酶都是关键的生物技术酶。由于其不对称催化合成手性胺的特点，转氨酶已成为工业上用于生产氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或医药中间体的常用酶之一。来自于土曲霉属(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，催化氨基供体上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮，反应过程需要磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)的参与，实验表明，ω-转氨酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，不利于应用到工业生产中，其热稳定性有待进一步提高。如CN105441404A、CN105950581A公开了利用定点突变技术对ω-转氨酶野生型进行改造，获得热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体，使其更适合工业应用。

转氨酶在合成手性胺方面具有较好的应用前景，但由于野生型酶在底物特异性、稳定性、催化效率等方面存在诸多不足，目前满足工业应用需求的转氨酶仍较为有限。基于非理性、理性及半理性设计策略的蛋白质工程技术能有效改善转氨酶的应用性能，为手性胺的高效制备提供了可能。随着转氨酶蛋白结构和催化机制相关研究的深入，利用理性或半理性设计策略对转氨酶进行分子改造的研究备受关注。

目前尚无利用转氨酶催化口袋疏水氨基酸位阻效应结合对硝基苯乙胺的显色反应，进而利用定点突变技术进行改造方法来提高土曲霉属(Aspergillus terreus)ω-转氨酶热稳定性的相关研究报道。

发明内容

本发明提供了一种ω-转氨酶突变体及其在制备西塞卡纳药物中间体的应用，旨在筛选出热稳定性和酶活极大提高的土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶突变体。