[发明专利]一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺

说明书

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺。本发明将从海南感染无乳链球菌导致发病的罗非鱼肾脏组织分离鉴定得到无乳链球菌株，分别经过菌种活化和菌种培养，培养过程简单，发酵时间短，所采用的复合液体培养基可以为无乳链球菌的生长和增殖提供必要的营养原料：同时所添加的酵母提取物与促生长剂协同作用，可以有效提高无乳链球菌培养过程中的活菌数，同时能欧有效提高无乳链球菌的菌体浓度以及C5a肽酶、Sip蛋白、LrrG蛋白等三种毒力蛋白的表达量，为进一步研制罗非鱼无乳链球菌疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺。

背景技术

罗非鱼（Tilapia）为一种中小型鱼，它是世界水产业重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一，罗非鱼是我国重要的出口型经济鱼类之一，其健康养殖的意义重大。

随着水产养殖集约化和规模化的迅猛发展，罗非鱼养殖密度不断加大，亩产可高达2万斤，随之带来的养殖病害、水体污染等问题不断加剧。当前，链球菌病是罗非鱼养殖所面临的严重重且难处理的病害之一，其传染性极强，死亡率高达 80%以上，严重影响罗非鱼产业发展。罗非鱼链球菌病的病原主要为无乳链球菌和海豚链球菌，其中以无乳链球菌为主。无乳链球菌是革兰氏阳性菌，表面光滑湿润并略显凸起，边缘比较整齐，呈圆形，乳白色，显微镜下可见一个或者多个球形或链状菌体。鱼体感染致病性链球菌后，表现功能异常、眼巩膜白浊和体表出血等特征，通常致死率较高。

对于罗非鱼链球菌病的防治，目前主要依赖于抗生素药物。但抗生素药物的长期使用所带来的菌株变异、药物残留和污染环境等严重问题已倍受社会关注。因此，从长远来看，开发有效的免疫防治技术，仍是控制罗非鱼链球菌病的主流方向，其中疫苗防治是一条国际推荐且被认可的既绿色又环保的重要途径之一。

疫苗的研制需要无乳链球菌的大规模培养，在无乳链球菌感染罗非鱼的过程中，荚膜多糖(GPS)、β-溶血素/溶细胞素CAMP 因子、C5a肽酶、透明质酸酶、超氧化物歧化酶和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶等毒力因子扮演着重要的角色。无乳链球菌的多种表面蛋白、β蛋白质、5a 肽酶、Lmb、FbsA、Sip等）具有重要免疫原性，在致病过程中可能起着重要作用。通过不同血清型GBS的多基因组分析和筛查研究显示C5a肽酶（简称ScpB）、Sip蛋白、LrrG蛋白经现有技术中实验证实具有较好的免疫原性，并且理论上存在于所有的 GBS 菌株中，因此成为制备 GBS 疫苗的主要候选成分，而现有技术中，对罗非鱼无乳链球菌中培养，获得的这三种毒力蛋白的含量较低，而想要获得大量的C5a肽酶、Sip蛋白、LrrG蛋白通常需要采用基因工程的方法，将所需的重组蛋白的编码基因构建到表达载体上，获得重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，使转化的宿主细胞表达产生所述无乳链球菌表面免疫原性重组蛋白。虽然通过上述方法能够特异性的得到用于生产疫苗所需要的蛋白，但是现有技术中，基因工程的技术方案复杂，同时对实验操作及实验条件的要求十分苛刻，不利于大规模的工业化生产。

因此，有必要提供一种罗非鱼链球菌的培养方法，通过简单的培养工艺，有效提高罗非鱼无乳链球菌中的三种毒力蛋白C5a肽酶、Sip蛋白、LrrG蛋白的高效表达，从而可以应用于制备控制罗非鱼无乳链球菌疾病的发生的高效疫苗。

发明内容

在为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺。本发明提供的罗非鱼无乳链球菌的培养工艺，能够有效提高无乳链球菌的菌体浓度以及C5a肽酶、Sip蛋白、LrrG蛋白等三种毒力蛋白的表达量。

本发明的技术方案是:

一种罗非鱼无乳链球菌的培养工艺，具体包括如下步骤：

S1、菌种活化：

将罗非鱼无乳链球菌菌种划线于BHI固体培养基上，培养，得活化菌种；

S2、菌种培养