[发明专利]一种具有二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的生物活性肽

说明书

本发明公开了一种生物活性肽，其来源于发酵马乳，其氨基酸序列为Ile‑Ala‑Phe‑Pro，其分子量为500.6Da，该生物活性肽具有二肽基肽酶Ⅳ抑制活性，对二肽基肽酶Ⅳ的半抑制浓度（IC₅₀）为0.001mol/L；且能改善高糖诱导Hepg2细胞模型的葡萄糖消耗能力，具有抑制Hepg2细胞模型的葡萄糖摄取的作用，在制备治疗或辅助治疗2型糖尿病的保健品和药物方面具有应用前景，且制备简单，适用于工业化生产和市场推广应用。

技术领域

本发明涉及一种发酵马乳中具有DPP-Ⅳ抑制活性的生物活性肽，属于生物活性肽生物技术领域。

背景技术

随着社会经济的发展，人们生活方式的改变，全球糖尿病的发病形势越来越严峻，发病人群日益年轻化的同时，还会引起很多慢性并发症。糖尿病是由体内胰岛素缺陷或其生物学效应降低，或两者同时存在而导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱的一种内分泌代谢疾病（WHO，2006）。所有的糖尿病类型中，2型糖尿病的发病率最高，占所有糖尿病的90-95％。在其发病机制中因DPP-Ⅳ能迅速灭活肠促胰岛素胰高血糖素样肽-1和糖依赖性胰岛素释放肽等多种激素，导致血糖上升，已成为治疗2型糖尿病的新靶点。目前DPP-Ⅳ抑制剂也已成为糖尿病药物开发的一个重要方向，常用的药物包括：维格列汀（Vitagliptin）、沙格列汀（Saxagliptin）、阿洛列汀（Aloliptin）以及利拉列汀（Lilaridine）。长期服用这些化学合成的DPP-Ⅳ抑制剂药物可能会产生如过敏反应、心率失调、上呼吸道感染、胃肠不适等副作用。

在乳源生物活性肽的降糖尿病的相关研究中，牛乳及其相关制品已被广泛研究。与牛乳相比，马乳中的酪蛋白仅有1.05%，可溶性蛋白高达1.03%，属于白蛋白性乳类，更容易消化吸收，可应用于功能性食品、保健品领域，具有广泛的市场应用前景。

发明内容

本发明提供了一种来源于发酵马乳的生物活性肽，该生物活性肽氨基酸序列为Ile-Ala-Phe-Pro，其具有二肽基肽酶Ⅳ抑制活性。

本发明以鲜马乳为原料，使用乳酸菌和乳源酵母菌共发酵制备发酵马乳；使用截留膜、葡聚糖凝胶和反向高效液相进行分离、纯化，获得具有DPP-Ⅳ抑制活性的生物活性肽，其氨基酸序列为：异亮氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸（IAFP），分子量为500.6 Da，对DPP-Ⅳ的半抑制浓度为0.001mol/L，并具有显著提高高糖诱导胰岛素抵抗Hepg2细胞模型活性，显著改善高糖诱导的胰岛素抵抗细胞Hepg2的葡萄糖消耗与葡萄糖摄取的能力。

本发明从经乳酸菌和酵母菌共发酵的马乳中分离纯化获得了能显著抑制DPP-Ⅳ活性的小分子肽IAFP。

本发明的DPP-Ⅳ抑制肽的制备工艺如下：

（1）菌种活化：乳酸菌按体积百分比0.5～2%的接种量接种于MRS液体培养基中，在25～42℃下静置培养8～20h，活化后菌液的活菌数不少于10⁹CFU/mL，酵母菌按体积百分比0.5～3%的接种量接种至YPD液体培养基中，在20～35℃、100～300rpm下培养8～48h，活化后菌液的活菌数不少于10⁸CFU/mL；两种菌均连续增殖2～4代，备用；

（2）鲜马乳通过过滤或离心净乳，60～150℃灭菌2s～30min；

（3）马乳降温至20～40℃时接种活化好的乳酸菌和酵母菌，接种量均为0.1%～5%，接种后马乳中的活菌数为10⁶～⁹CFU/mL；

（4）马乳进行发酵，发酵条件为：20～40℃、搅拌转速20～200rpm、通气量10～200vvm的条件下发酵4～60h；

（5）马乳发酵结束后离心获取上清，调节上清pH至6～9，再次离心去除蛋白；离心条件为：2～10℃ 、9000g～12000g 离心10～30min；

（6）获取的上清进行真空冷冻干燥或旋转蒸发浓缩；