[发明专利]一种生殖支原体parC基因突变类型的检测方法与试剂盒

说明书

本发明提供了一种生殖支原体parC基因突变类型的检测方法与试剂盒，所述检测方法用于检测生殖支原体parC基因的8个突变类型，其中8个突变类型的检测靶标为(1)ParC S83I，(2)ParC S83C，(3)ParC S83N，(4)ParC S83R，(5)ParC D87G，(6)ParC D87N，(7)ParC D87H，(8)ParC D87Y，本发明进一步提供分别针对8个突变类型检测的反应引物序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9，本发明利用高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)结合未标记探针检测所述8个突变类型。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种生殖支原体parC基因的8个突变类型的检测方法，特别涉及一种生殖支原体parC基因的8个突变类型的方法及其试剂盒。

背景技术

生殖支原体于1980年首次从两名男性非淋菌性尿道炎患者的样本中分离出来。生殖支原体感染在男性非衣原体非淋菌性尿道炎中占10-35％。在女性患者中，生殖支原体与宫颈炎和盆腔炎(PID)有关。然而，由于缺乏可靠的检测方法，在该病原体被发现的后续10年间，生殖支原体在细菌的临床重要性确定的方面几乎没有什么进展。生殖支原体一种生长极其缓慢且挑剔的细菌，而新的分离株是在经过一系列技术培养后才获得的，在Vero细胞中的临床样本共培养技术已经建立。生殖支原体培养周期长(长达六个月)，并且培养的灵敏度差。因此，生殖支原体相关培养技术的开发对生殖支原体的耐药流行病学监测和以及了解其背后的遗传机制至关重要。实际上，有研究表明，核酸检测法(NAATs)的灵敏度高于培养法。

生殖支原体感染是男性非衣原体非淋菌性尿道炎主要致病病原体，与女性宫颈炎和盆腔炎(PID)有关。目前尚未有针对生殖支原体的有效疫苗，有效的抗菌治疗仍是治疗和控制生殖支原体感染的主要手段。大环内酯类抗生素(阿奇霉素)是生殖支原体感染的指南推荐一线用药。但是由于阿奇霉素的运用场景广泛，且用药剂量高，在很多地区的生殖支原体感染中的耐药率已经高达50％。因此，二线推荐用药氟喹诺酮类抗生素(氟喹诺酮)逐渐在很多地区成为生殖支原体感染的主要用药。不幸的是，近年来不断有氟喹诺酮耐药的生殖支原体临床样本被报导，严重地威胁着当前推荐的治疗方案。

加强生殖支原体氟喹诺酮耐药性的监测是控制和预测耐药趋势的必要手段，以确保当前推荐治疗方案的有效性。常规的耐药检测手段主要是基于细菌的分离培养法，通过纯培养获得分离株，观察分离株在相应的抗生素浓度下的生长情况从而对淋球菌的耐药性进行评价。但是由于生殖支原体极其难培养，该方法在临床及实验室都难以实行，而全基因组测序技术(Whole-genome sequencing，WGS)，通过获得生殖支原体的全基因组序列信息，进而分析携带的耐药情况，已成功应用于生殖支原体的分子流行病学筛查和耐药性监测。全基因组测序技术的优势是显而易见的，它可以提供更全面的耐药信息，追踪不同耐药株亲缘关系与进化关系，分析特定人群、地区的耐药株分布与变异。但是成本高昂、需要专业的人员进行数据分析，并且一次可处理的样本有限。幸运的是在过去几十年年里，在研究生殖支原体的分子耐药机制方面取得了巨大进展，使得建立分子筛查方法以检测特定的耐药基因成为可能。一系列核酸扩增方法(Nucleic acid amplification testing，NAAT)凭借耗时短、操作简便、自动化等优点快速建立起来，取代培养法逐渐成为检测生殖支原体耐药性的首选。氟喹诺酮耐药主要由parC基因的83与87位点的突变介导，常规的NAAT技术均以这两个位点为检测氟喹诺酮耐药的分子靶标。然而，由于上述两个位点突变十分复杂(ParCS83I，S83C，S83N，S83R，D87G，D87N，D87H，D87Y)，常规的NAAT技术均无法覆盖所有突变型。现有的荧光定量PCR方法为覆盖所有突变型需要设计多孔和多条探针，大大地增加了这些方法在应用中的成本。