[发明专利]构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法

权利要求书

1.构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、样本预处理：将切取的肿瘤组织用聚维酮碘溶液和0.9%氯化钠溶液依次冲洗2～3次后，放入含有5%青霉素/链霉素及2%promocin的RPMI 1640保存液中；

b、清洗：去除RPMI 1640保存液，将组织加入到含有1×Glutamax、10mM HEPES和5%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液中，振荡清洗，静置5min；此步骤应重复2~3次；

c、消化：去除步骤b中培养基，将清洗好的组织用剪刀剪碎至1mm×1mm大小，加入改良的DMEM/F12培养液，置入37℃水浴锅中消化60min，每隔15min剧烈振荡一次；

d、去除杂质：将消化后的组织悬浮液转移至离心管中，加入10mL AdDF+++清洗2～3次后，过滤，收集滤液；向滤液中加入红细胞裂解液，处理完成后加入AdDF+++，清洗，离心，弃掉上清，取沉淀物；

e、固化：在冰上进行，沉淀物用HEPES缓冲液清洗，重悬，加入Matrigel，充分混匀；吸取细胞悬浮液滴入到预热的培养板中，37℃条件下固化5min；

f、培养：将改良的DMEM/F12培养液加入固化后的Matrigel中，置于含5%CO₂的37℃细胞培养箱内培养；每2~4天更换培养基，直至类器官大小超过200微米或类器官长满基质胶；

步骤f中，所述改良的DMEM/F12培养液以DMEM/F12培养液为基础，加入N-Acetylcysteine、EGF、FGF-10、FGF-basic、Y-27632、A-83-01、SB202190、Nicotinamide、PGE2、Noggin、 R-Spondin、HEPES、GlutaMAX、B27、N2、青霉素和链霉素。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤g、传代：去除培养液，PBS清洗，加入TrypLE Express，用移液枪吹打，将Matrigel打散，每隔10~15min吹打1次，直至类器官被消化成单个细胞；加入 1mL Advanced DMEM/F12培养基与TrypLE Express混合，200g离心5min，去除上清，将细胞沉淀用Advanced DMEM/F12 培养基重悬细胞，再加入Matrigel，充分混匀，进行传代培养，每2~4天更换培养基，每7～14天传代一次。

3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤h、冻存：离心收集步骤f培养或步骤g传代获得的类器官，加入类器官冻存液，形成细胞悬液，转移至低温冻存管中，程序性降温，降温完成后将冻存管放入-80℃深低温冰箱中，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。

4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤i、复苏：将冻存管至于37℃，间歇摇动冻存管令其尽快融化，融化后加入advanced DMEM/F12培养基，混匀后200g离心5min，弃去上清液，保留细胞沉淀；加入advanced DMEM/F12重悬细胞沉淀，再加入Matrigel，混匀，吸取混合液至37℃条件下预热30min的培养板中， 5%CO₂的37℃细胞培养箱内培养，冻存类器官复苏完成。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤b中，所述DMEM/F12培养液中含有AdvancedDMEM/F12和AdDF+++。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤c中，所述改良的DMEM/F12培养液含0.5～1.0mg/mL 的II型Collagenase、500U/mL的IV 型Collagenase和10µM的RHO/ROCK pathwayinhibitor。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于，经步骤c处理后仍未成功消化的组织可用TrypLE Express在37℃水浴锅中继续消化20min。

8.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤d中，过滤参数为70µm；离心参数为300g×5min。

9.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤e中，加入Matrigel充分混匀后，使细胞浓度为1×10⁶/mL。