[发明专利]一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统

说明书

本发明公开了一种脱水四环素诱导的大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统，属于基因工程领域。本发明构建了在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中均可使用脱水四环素诱导表达的操纵子Psubgt;tet/subgt;表达系统，该系统以商业化质粒pHT01为表达载体，包括阻遏蛋白tetR表达框和超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框。其中对阻遏蛋白tetR表达框中的阻遏蛋白tetR的基因序列和RBS序列进行突变以改变阻遏蛋白亲和力和表达强度。操纵子Psubgt;tet/subgt;表达系统在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均表现出低泄漏和高的诱导放大倍数。因此本通用表达系统结构简单、活性高、调控严谨，在异源蛋白高效表达和合成生物学研究中有广阔的应用前景。

技术领域

本发明了涉及一种脱水四环素诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌通用型诱导表达系统，属于基因工程学领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌作为一类革兰氏阳性菌，由于其良好的生物安全性，较强的分泌能力，无密码子偏好性而被广泛应用与各种蛋白酶制剂和有价值的蛋白质的生产。枯草芽孢杆菌表达异源蛋白存在多种表达系统，以不同启动子特性来分，主要有自诱导表达系统、组成型表达系统、诱导型表达系统。启动子从功能上主要分为组成型启动子和诱导型启动子两类。组成型启动子在菌体的生长各个阶段都可以表达外源基因，而诱导型启动子在没有被诱导时表现无活性或者低活性，在加入诱导剂之后启动子的活性大幅提高进而高效表达外源基因。诱导型启动子由于其活性可控而被广泛应用，人们可以通过调控加入诱导剂的试剂和浓度控制外源基因的表达时间和强度。

目前在枯草芽孢杆菌当中应用较为广泛的主要有IPTG诱导系统和木糖诱导系统。其中，IPTG诱导系统主要基于pHT系列载体构建而成，使用的是非天然的杂合启动子和大肠杆菌的LacI阻遏蛋白和结合位点；而木糖诱导系统通常使用天然的PxylA启动子和XylR阻遏蛋白。虽然IPTG、木糖等诱导系统在枯草芽孢杆菌中被广泛使用，但由于木糖是碳源会被利用、IPTG对人体有毒、表达强度有限、在大肠杆菌中是组成型表达无法诱导等缺点，在实际使用中均出现一定的问题；如在表达一些对菌体产生毒性的蛋白时，在大肠杆菌中的泄漏表达经常使基因序列发生突变而提前终止表达，无法构建大肠-枯草通用诱导调控系统。

因此，需要开发一种基于新型诱导剂、调控严谨、在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中通用的诱导型表达系统，对后续酶工程、代谢工程等领域打下基础。

发明内容

枯草芽孢杆菌中常用的IPTG、木糖等诱导系统在大肠杆菌中组成型表达无法诱导，不利于蛋白表达载体的构建与调控系统的构建；通用诱导型表达系统要求阻遏蛋白要在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表现出足够的亲和强度和表达强度以降低启动子的泄漏使调控更严谨。

本发明提供了一种阻遏蛋白tetR表达框，所述表达框由启动子P21、RBS序列和阻遏蛋白tetR构成；所述启动子P21的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.9所示，所述阻遏蛋白tetR的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或阻遏蛋白为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的阻遏蛋白tetR的第119位的苯丙氨酸突变为酪氨酸得到的。

本发明还提供了一种表达系统，所述表达系统由表达载体、上述表达框及目的基因构成，所述目的基因含有P_tet启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因包括但不限于超级折叠绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸苷酶、β-半乳糖苷酶或参与微生物代谢调控的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pHT01质粒、pSTOP1622质粒、pJOE8999质粒或pAD123质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述P_tet启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。