[发明专利]一种高效制备交链孢酚的方法

说明书

本发明提供了一种高效制备交链孢酚的方法，该方法包括如下步骤：将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，黑暗条件下活化；取小块接种于新的培养基进行培养；在旋转涡旋仪上涡旋，收集提取液；提取液过滤、蒸干；乙酸乙酯提取、蒸干；两次中压制备；重结晶。本发明的高效制备交链孢酚的方法，简化了提取净化步骤，保护色谱柱，极大的提高了制备效率的同时显著降低成本。通过本发明的方法制备得到的交链孢酚产量高、纯度高，可作为标准品应用于食品中交链孢酚的检测、防控及其毒理学研究。

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体的说涉及一种高效制备交链孢酚的方法。

背景技术

交链孢酚(Alternariol，AOH)是由链格孢属(Alternaria spp.)真菌侵染农作物后在适宜温度和湿度下产生的一种二苯并-α-吡喃酮类链格孢霉毒素。它在1953年首次由Raistrick从微生物中分离得到，为白色粉末状固体，分子式：C₁₄H₁₀O₅，分子量：258.23，易溶于甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜等有机溶剂。

交链孢酚是在谷物、饲料及果蔬中存在的最普遍的链格孢霉毒素之一，可通过食物链对人类和动物健康造成严重危害。研究表明，交链孢酚主要通过造成机体的氧化应激产生ROS并与DNA拓扑异构酶相互作用，导致DNA单链和双链断裂，进而阻止细胞增殖，此外，交链孢酚在结构上类似于雌二醇，表现出雌激素效应并干扰类固醇生成。

欧洲食品安全局(EFSA)采用毒理学关注阈值(TTC)来评价交链孢酚对人体造成的潜在风险，其TTC值为2.5μg/kg body weight/day。但是目前尚无适用于食品和饲料中交链孢酚的限量标准，且交链孢酚的代谢分布研究较少，其进入动物体后的动力学规律仍不清楚，而研究AOH的毒理学及其在体内的迁移转化、分析检测和风险评估等需要用到大量的标准品。

目前，交链孢酚的制备方法主要为溶剂分配法、索氏抽提法和硅胶柱层析法等，但这些方法都很耗时且目标物纯度较低，不适用于大规模制备。Chu等以大米培养基为产毒基质，二氯甲烷为提取溶剂，首次采用半制备及制备液相分离纯化三种链格孢霉毒素，极大地提高了制备效率且目标物纯度达到95％，但该方法培养周期较长，提取溶剂毒性较大，制备步骤复杂，不适用于工业级制备。而且目前的交链孢酚标准品，价格昂贵约为1500元/mg。

因此，迫切需要开发新的交链孢酚的纯化制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效制备交链孢酚的方法，该方法包括如下步骤：将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，黑暗条件下活化培养；取小块接种于新的培养基进行培养；在旋转涡旋仪上涡旋，收集提取液；提取液过滤、蒸干；乙酸乙酯提取、蒸干；两次中压制备；重结晶。

具体的说，本发明的一种高效制备交链孢酚的方法，该方法包括如下步骤:

(1)将互隔交链孢菌(ATCC 66981，购自美国模式培养物集存库(Americantypeculture collection，ATCC))接种在PDA培养基上，20-40℃黑暗条件下活化培养3-10d；

(2)用无菌牙签从步骤(1)得到的PDA培养基菌丝边缘上取小块接种于新的培养基进行培养，培养的条件为：

③PDA或PDB培养基(培养基初始pH 4-7)在20-40℃黑暗条件下培养5-10d；或者是：

④大米或玉米培养基在20-40℃黑暗条件下培养20-40d；

(3)将步骤(2)得到的培养基转移到锥形瓶中，加入乙腈，在旋转涡旋仪以100-500rpm/min的速度涡旋1-5min，然后超声0.5-3h，重复此步骤2-5次，收集提取液；

(4)将步骤(3)得到的提取液用纱布过滤到旋蒸瓶中，旋转蒸发仪30-60℃下旋蒸，直至液体全部蒸干；