[发明专利]一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法

权利要求书

1.一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)构建出CPP-mCherry蛋白表达质粒pET28a-CPP-mCherry：将穿膜肽、4个甘氨酸连接肽、荧光蛋白mCherry融合表达基因构建于大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)中；

(2)将质粒pET28a-CPP-mCherry用氯化钙化学转化法转化入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中；

(3)将CPP-mCherry重组表达菌株接种于含卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，220rpm活化8h，将活化菌株以1:100的体积比接种于250mL 2×YT培养基中，加入250μL浓度50-55mg/mL的卡那霉素后培养4.5-5.5h，待OD₆₀₀值达到0.6～0.8，将菌液降温至16℃后添加IPTG，于16℃、220rpm诱导表达16～20h；

(4)CPP-mCherry融合蛋白纯化及浓缩：将诱导表达的菌液离心后收集菌体，在菌体中加入30mL PBS溶液，将菌体剥离下来后于涡旋仪上彻底重悬，将重悬菌体超声破碎，然后将破碎后的菌液离心、收集上清；钴亲和层析柱经PBS平衡3-5个柱体积后，将收集的上清过柱，并重复挂柱一次；用PBS洗3-5个柱体积，用添加含5mM咪唑的PBS洗3-5个柱体积，用含150mM咪唑的PBS洗5-8个柱体积，收集所有洗脱液；用含500mM咪唑的PBS洗3-5个柱体积，将收集的蛋白透析、浓缩，得到细胞穿膜肽-目的蛋白重组融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的穿膜肽及其氨基酸序列为下列一种：

Tat：YGRKKRRQRRR；

ANTP：RQIKIWFQNRRMKWKK；

KFF₃K：KFFKFFKFFK；

R₉：RRRRRRRRR；

K₉：KKKKKKKKK；

KH₉-BP100：KHKHKHKHKHKHKHKHKHKKLFKKILKYL；

步骤(4)对应得到的细胞穿膜肽-目的蛋白复合物为Tat-mCherry、ANTP-mCherry、(KFF)₃K-mCherry、R₉-mCherry、K₉-mCherry、(KH)₉-BP100-mCherry中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述LB液体培养基中的卡那霉素浓度为50-55μg/mL，IPTG终浓度为0.1-0.4mM。

4.根据权利要求1所述的一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，重悬菌体超声破碎时间为15min，超声2s，停歇4s，超声过程于黑暗环境下操作。

5.根据权利要求1所述的一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，蛋白透析、浓缩的具体步骤如下：将收集的蛋白装入透析袋，浸没在PBS溶液中，避光、4℃透析过夜，将透析后的蛋白置于蛋白浓缩管中，离心，将蛋白浓缩至浓度为150μM，实验操作全程避光。

6.根据权利要求1所述的一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：还包括步骤(5)，钴亲和层析柱复性：用ddH₂O洗6-8个柱体积，然后用0.4N NaOH洗2个柱体积，立即用ddH₂O洗6-8个柱体积，接着用0.1M的EDTA洗柱，用ddH₂O洗6-8个柱体积后，立刻以0.1M CoCl₂洗5-8个柱体积并室温孵育15min，孵育完成以大量的ddH₂O冲洗后，用PBS洗3-5个柱体积平衡。

7.一种高效的链霉菌活细胞外源蛋白导入方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)链霉菌孢子的处理：在链霉菌平板上添加PBS溶液，然后用接种环将链霉菌孢子刮下，用移液枪吹打混匀后，将菌液均分置于离心管中，离心收集菌体，用PBS洗涤2次后，吸去多余溶液，获得链霉菌孢子体；

(2)取链霉菌孢子体，加入细胞穿膜肽-目的蛋白复合物，所述细胞穿膜肽-目的蛋白复合物为Tat-mCherry、ANTP-mCherry、(KFF)₃K-mCherry、K₉-mCherry、R₉-mCherry、(KH)₉-BP100-mCherry中的一种，用PBS稀释至50μM，取稀释液100μL，添加至细胞，混匀，34℃，避光孵育1h；

(3)孵育后，离心弃掉上清，加入PBS重悬洗涤一次，离心倒去上清后加入0.25％的胰蛋白酶，37℃消化3～5min，然后离心，用PBS洗涤两次后，将菌体用PBS重悬。