[发明专利]一种α-半乳糖苷酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一类高比活的α‑半乳糖苷酶突变体及其应用。本发明以来源于Anoxybacillus vitaminiphilus的α‑半乳糖苷酶AgaV为模板，采用分子生物学技术进行氨基酸突变，得到一类催化效率提高的突变体，包括G355D、G355E、G355F、G355H、G355I、G355K、G355L、G355N、G355Q、G355R、G355T、G355V和G355Y。本发明所述的突变体具有催化效率高的优良性质，对以D‑半乳糖和甘油为底物催化合成异红藻苷的效率提高了1.3‑3倍，有利于降低异红藻高合成的成本，提高了使用该酶生产异红藻苷的转化效率，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一类α-半乳糖苷酶突变体及其应用。

背景技术

半乳糖基-甘油是一种由D-半乳糖基和甘油组成的醇溶性半乳糖苷，存在于许多红藻和海藻类当中。α-D-半乳糖基-甘油和β-D半乳糖基-甘油广泛用于化妆品、保健品、食品和药物。一般，α-D-半乳糖基-甘油有两种对映体形式：红藻糖苷和异红藻苷，在藻细胞中主要发挥抗渗透压等作用，同时具有化学抗氧化、抗炎、免疫调节及清除自由基等作用。研究表明，异红藻苷是红藻的主要光合产物，红藻(海萝和坛紫菜)已被证实含有高浓度的异红藻苷。

目前，异红藻苷尚未有化学合成法，主要采用醇提工艺从红藻中获得，但是这种方法存在提取工艺复杂，效率低等问题。

利用α-半乳糖苷酶催化甘油和D-半乳糖逆水解反应合成异红藻苷具有原子经济性高、成本低等优点，并且结合蛋白质工程手段提高α-半乳糖苷酶酶活对提高异红藻苷的产量具有重要意义。

发明内容

本发明通过定点饱和突变对来源于维生素芽孢杆菌Anoxybacillusvitaminiphilus的α-半乳糖苷酶进行理性改造，获得一系列α-半乳糖苷酶突变体，可以作为生物催化剂，催化底物甘油和D-半乳糖逆水解反应，生产异红藻苷，提高异红藻苷的转化率。

本发明具体技术方案如下：

一种α-半乳糖苷酶突变体，在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列基础上具有G355突变，第355位的甘氨酸突变为天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸。

优选第355位的甘氨酸突变为组氨酸。本发明另一目的在于提供一种DNA分子，所述DNA分子编码本发明所述的α-半乳糖苷酶突变体。

本发明另一目的在于提供一种α-半乳糖苷酶突变体的表达载体，表达如本发明所述的α-半乳糖苷酶突变体。所述表达载体，含有编码本发明所述的α-半乳糖苷酶突变体的DNA分子。所述表达载体为质粒、噬菌体、病毒或宿主细胞。

所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，可以为大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉或木霉，优选大肠杆菌。

本发明另一目的是提供上述α-半乳糖苷酶突变体、DNA分子或α-半乳糖苷酶突变体的表达载体在制备异红藻苷中的应用。

综上所述，本发明优点如下：本发明以来源于Anoxybacillus vitaminiphilus的α-半乳糖苷酶AgaV(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)为模板，采用计算机辅助设计寻找潜在的氨基酸活性位点，共得到四个潜在的位点：I348、I591、V618和G355。进一步对这4个位点进行饱和突变，考察各突变体的酶活和合成异红藻苷的相对转化率。研究结果显示，I348、I591、V618饱和突变的突变体，对异红藻苷的转化率均没有显著提高，G355位点的若干突变体具有催化效率高的优良性质，对以D-半乳糖和甘油为底物催化合成异红藻苷的效率提高了1.3-3倍，其中G355H对异红藻苷的转化率提升幅度最为显著，为原始酶的3倍。本发明有利于降低异红藻高合成的成本，提高使用该酶生产异红藻苷的转化效率，大大降低了生产成本，具有重要的应用价值。

附图说明