[发明专利]基于共进化分析的持续性内切葡聚糖酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及一类酶活显著提高的持续性内切葡聚糖酶突变体及其应用。本发明所述突变体包含氨基酸序列的第51位和/或第93位氨基酸突变，所述内切纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1。本发明采用迭代饱和突变技术，基于进化耦合分析，通过选择具有高耦合强度的氨基酸残基对作为关键突变位点优化持续性内切葡聚糖酶的分子结构、提高酶活。与野生型酶相比，本发明所述持续性内切葡聚糖酶突变体的外切酶和内切酶活性显著增强，对纤维素底物的高效降解和降低生成成本具有重要的意义。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一类酶活提高的持续性内切葡聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

纤维素是地球上分布最广、储量最丰富的可再生资源，其高效的生物转化对实现我国“碳中和”的远景目标、解决能源危机和促进社会可持续发展具有重要的意义，然而水解过程中需要的酶种类多、用量大，导致的酶成本过高等问题仍然是限制纤维素转化技术商业化的一个重要瓶颈。

持续性内切葡聚糖酶(Processive endoglucanase)作为一类双功能纤维素水解酶，可高效降解纤维素生成小分子寡糖，然而目前持续性内切葡聚糖中外切酶活性较弱、持续性差等问题，严重影响了该酶在纤维素低成本高效生物转化领域的应用。此外，持续性内切葡聚糖酶的蛋白质工程改造目前主要集中在催化通道周围的芳香族氨基酸和一些来自特定区域(酶活性架构区域)内的特殊氨基酸，研究范围狭窄，导致一些潜在的关键氨基酸残基被遗漏。

在蛋白质进化过程中，有相互作用残基对之间存在一种“共进化”模式，即当一个残基发生变异时，与其有相互作用的残基也要发生相应的变异，以维持整体空间结构及生物学功能。共进化位点残基之间的协同作用与基于变构相互作用、上位相互作用、补偿性相互作用和协同效应的蛋白质结构和功能密切相关。近年来，通过结构生物信息学和计算生物学预测接触残基对，发现残基的共同进化被发现是可行的，并且随着蛋白质序列数据库规模的加速增长，越来越多的计算机辅助软件被开发用于共进化位点的预测。如EVfold、GREMLIN ConKit和RaptorX-Contact等，已被提出用于检测共进化的残基并有效改善酶的催化性能。Wang(FEBS Letters，2020，594：799-812)等为了探索提高Bacillusnaganoensis来源的普鲁兰酶的催化活性，采用EVfold和GREMLIN辅助软件，筛选得到七组可能存在共进化关系的氨基酸残基对(D614/H539、E530/T520、D541/D473、E777/T730、K631/Q597、V328/I565、Y392/Y571)，采用饱和突变和组合突变等技术获得了多个催化活性显著提高的突变体。其中突变体K631V/Q597K/D541I/D473的催化效率相比于原始酶提高了6.3倍，提升效果显著。同样，Huang(Applied Microbiology and Biotechnology，2020，104：8299-8308)等为了增强Penicillium oxalicum 16来源的β-葡聚糖酶的多种酶特性进而提高纤维素乙醇的产量，基于共进化理论，鉴定了一个三重突变体G414G/D421V/T441S，其最适温度更接近发酵温度，催化效率同样得到提高，最终纤维素乙醇的产量相比于原始酶提高了22％。

尽管国内外研究者通过蛋白质工程改造技术提高纤维素酶催化活性的研究已经取得了非常显著的进展。然而目前对持续性内切葡聚糖酶持续性机制仍缺乏整体系统的理论认识，难以满足持续性内切葡聚糖酶定向设计与改造的需求，因此基于大规模序列比对的共进化分析方法不仅为蛋白质工程技术改造持续性内切葡聚糖酶以提高其催化活性提供了理论指导，同时有助于阐释该类酶的特殊催化机制。

发明内容

本发明采用迭代饱和突变技术，基于EVfold和GREMLIN生物信息工具对持续性内切葡聚糖酶同源序列进行比对分析，计算氨基酸残基间的相关程度，将生成的蛋白质共进化网络映射到相似度较高的参比序列上，选择存在共进化关系的关键氨基酸残基对优化纤维素酶的分子结构、提高酶活，获得一类酶活显著提高的持续性内切葡聚糖酶突变体。本发明所述的持续性内切葡聚糖酶的突变体具有较高的催化活性，为纤维素原料的工业话生物转化提供新的可行性。