[发明专利]一种用于检测G-CSFR的流式检测试剂及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种用于检测G‑CSFR的流式检测试剂，其有效成分为连接有荧光素的人源重组G‑CSF。本发明还提供了相应的制备方法，以及基于该流式检测试剂制备的检测试剂盒。本发明弥补了现有流式检测以抗体为主的缺陷，填补了现有技术空白，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及医学诊断技术领域，具体涉及用于检测G-CSFR的流式检测试剂及其制备方法和应用。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是由单核细胞和巨噬细胞产生的一种细胞生长因子，通过与效应细胞表面特异性受体G-CSFR结合，激活复杂的信号转导系统，发挥多种生物学功能，包括调节髓系细胞的增殖、分化与存活。目前，在临床上G-CSF广泛应用于粒细胞减少性疾病及化疗后粒细胞缺乏的病征，G-CSF也是自体或异基因移植时外周血干细胞强有力的动员剂，而且G-CSF联合化疗的预激方案在治疗难治、复发、老年的急性髓系白血病及骨髓增生异常综合症中也取得良好疗效。

G-CSFR是一种高亲和力受体，分布于髓系定向造血祖细胞、中性粒细胞、内皮细胞、髓系白血病细胞、部分幼稚淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及某些非造血细胞。正常情况下，G-CSFR与G-CSF结合，能够促进髓系前体细胞的生长和维持，促使髓细胞最终分化成粒细胞。但G-CSFR的异常表达、基因突变等会导致G-CSF的信号转导紊乱，通常与恶性先天性中性粒细胞减少症、急性髓系白血病、慢性中性粒细胞白血病、非典型慢性粒细胞白血病等疾病的发生、发展密切相关。近年来，随着分子遗传学以及临床研究的深入，对于G-CSFR的异常表达或基因突变在相关血液病发病以及治疗中的具体作用的研究取得较多新进展。但是，由于检测手段的局限、患者的多样性、血液肿瘤细胞的生物学及遗传学的异质性等因素，有关G-CSFR的一些研究报道尚存在争议，G-CSFR与临床诊断、治疗以及预后的关系尚待深入的探讨。

流式技术是经典的单细胞检测技术，能够对细胞表面标志物进行多参数检测。传统流式使用荧光基团偶联抗体，基于抗体与细胞表面抗原特异性结合的特性，利用荧光光路，检测细胞表面标志物。但是该技术也有局限，即细胞表面抗原产生突变，则可能导致其与相应抗体结合失效，致使流式技术无法检测出细胞表面标志物与抗体结合的信号。目前市场上的流式检测试剂均为抗体制备，均无法避免抗原突变问题，这极大的限制了医学研究及临床应用。

发明内容

本发明针对上述现有技术中存在的技术问题，提供了一种以细胞因子G-CSF为基础的检测G-CSFR的流式检测试剂。细胞因子多为低分子质量的蛋白质或糖蛋白，与细胞因子受体间呈高亲和力，是抗原抗体亲和力的100-1000倍，且两者之间的结合是完整结合，受体发生突变对两者之间结合并无影响。该试剂很好的弥补了现有流式检测以抗体为主的缺陷，填补了现有技术空白，具有良好的应用前景。

本发明首先提供了一种用于检测G-CSFR的流式检测试剂，有效成分为连接有荧光素的人源重组G-CSF；所述荧光素选自异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC)中的任一种。

在根据本发明的一个实施方案中，所述人源重组G-CSF的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。

序列SEQ ID NO:1

在根据本发明的一个实施方案中，还包含溶剂，所述溶剂为PBS。

本发明还提供了上述的流式检测试剂的制备方法，包括：

1)将FITC试剂与MES混合，混匀后得到FITC浓度为10mg/mL的混合液；

2)向所述混合液中加入过量的EDC和NHS，混匀并于室温反应15min；

3)加入巯基乙醇，终止EDC活化反应，并调pH至7.2，得到活化的混合液；