[发明专利]无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法

说明书

本发明提出一种无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法，属于分子生物学领域，能够解决现有的内毒素去除方法存在操作复杂、成本高、去除效果差且有RNA残留的技术问题。其中，本发明无内毒素质粒快速提取试剂盒包括裂解试剂组、杂质去除试剂、内毒素清除试剂、洗脱试剂组和至少一个吸附柱；质粒提取方法包括：样品重悬与裂解、内毒素清除、杂质去除、杂质漂洗和质粒DNA洗脱步骤。利用本发明的无内毒素质粒快速提取试剂盒提取的质粒内毒素含量低于0.1EU/μg，能够满足细胞转染、基因治疗、基因工程等需较低水平内毒素的实验和研究要求。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法。

背景技术

质粒DNA的提取纯化是现代分子生物学研究和应用中最基本且尤为关键的实验技术之一，高纯度的质粒DNA是基因克隆、基因序列分析的重要前提，尤其是涉及核酸疫苗、基因治疗等对内毒素含量要求极高的研究领域尤为关键。

本领域最常用的提取质粒方法是碱裂解法，该方法是分子克隆研究中最常用的方法之一。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分脂多糖，细菌裂解时会随之释放出来，该物质能显著降低内毒素敏感细胞株的转染效率，因此，利用常规试剂盒提取的质粒DNA无法满足细胞转染、基因治疗、基因工程等需较低水平内毒素的实验和研究。目前，内毒素去除策略有两种：一是在质粒DNA结合阶段去除；二是在质粒DNA洗脱后去除，其中，去除方法主要有液相分离法和固相介质法，如分子筛等。但是，目前市场上液相分离法的优点是成本低，但去内毒素效果差且有RNA残留；而固相介质法成本高，操作复杂，优点是去内毒素效果好，可见，现有的内毒素去除方法各有优劣。

因此，对于无内毒素高纯质粒DNA提取而言亟需一款成本低、纯度高、效率高、去内毒素效果佳的试剂盒。

发明内容

本发明针对现有的内毒素去除方法存在操作复杂、成本高、去除效果差且有RNA残留的技术问题，提出一种无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法，具有成本低、纯度高、提取效率高且去内毒素效果佳等特点。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

无内毒素质粒快速提取试剂盒，包括裂解试剂组、杂质去除试剂、内毒素清除试剂、洗脱试剂组和至少一个吸附柱；

其中，所述内毒素清除试剂含有pH＝6.5-7.5、浓度为10-200mmo/L的Tris-HCl缓冲液、浓度为10-200mmo/L氯化钠、体积分数为10％-20％的Triton X-114、质量体积比为0.0001％-0.005％的溴酚蓝。

在一实施方式中，裂解试剂组包括菌体重悬剂、碱性裂解液和中和溶液。

在一实施方式中，菌体重悬剂含有pH＝8.0、浓度为20-50mM的Tris-HCl缓冲液、pH＝8.0，25℃，浓度为10-20mM的EDTA，浓度为100mg/mL的RNase A；

碱性裂解液含有浓度为150-200mM的NaOH和1％-10％的SDS；

中和溶液含有浓度为4-6M的盐酸胍和pH＝4.2，浓度为0.5-1.0M的醋酸钾溶液。

在一实施方式中，杂质去除试剂为去蛋白液，其含有pH＝7.0-7.5，浓度为4-6M盐酸胍、浓度为10-200mM的Tris-HCl缓冲液和体积分数为40％-60％的异丙醇。

在一实施方式中，洗脱试剂组包含漂洗液和洗脱液。

在一实施方式中，漂洗液含有pH＝7.0-7.5，浓度为10-100mM的氯化钠、浓度为10-100mM的Tris-HCl缓冲液、体积分数为50％-80％的无水乙醇；

洗脱液含有pH＝8.0-8.5，浓度为0.01-0.1mM的EDTA和浓度为10-100mM的Tris-HCl缓冲液。