[发明专利]一种II型草鱼呼肠孤病毒VP6重组乳酸菌的构建和应用

说明书

本发明公开了一种II型草鱼呼肠孤病毒VP6重组乳酸菌的构建和应用，所述重组乳酸菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：M2022323。通过相关检测证明了重组乳酸菌可以通过口服免疫将抗原直接呈递给消化道免疫系统中的抗原呈递细胞，能够刺激鱼体同时产生局部黏膜免疫应答和系统免疫应答反应、提高鱼体产生特异性和非特异性免疫应答反应。提高免疫后稀有鮈鲫在GCRV感染过程中存活率，相对存活率(RPS)为42.9％，饲喂L.lactis pNZ8148‑VP6在GCRV感染过程中具有较好的生态防控效果。

技术领域

本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种II型草鱼呼肠孤病毒VP6重组乳酸菌的构建和应用。

背景技术

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国产量最高的淡水养殖鱼类，具有重要的经济地位。然而死亡率高达80％的草鱼出血病(Grass carp hemorrhagic disease,GCHD)频繁爆发，但目前尚无有效的治疗措施。GCHD由草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)感染草鱼引起，流行病学调查结果显示目前主要的流行毒株的基因型是GCRV-II型。接种疫苗是保护草鱼抵御GCRV感染的最有效方法。

GCRV病毒基因组由11条大小不同且不连续的双链RNA节段组成，可编码12种蛋白，包括7种为结构蛋白和5种为非结构蛋白。其中，结构蛋白VP1由GCRV S1节段编码，推测具有病毒RNA转录时的甲基转移酶活性(methylase)，参与病毒mRNA复制过程中的加帽，但免疫家兔后产生的抗体中和活性不高。VP2蛋白由GCRV S2节段编码，推测具有RNA聚合酶活性。VP3蛋白由GCRV S3节段编码，推测具有核苷水解酶活性和RNA解旋酶活性，主要参与病毒转录过程中的能量供应。通过重组杆状病毒组装的II型GCRV VP3、VP4和NS38 颗粒样病毒免疫草鱼后可产生免疫保护。但是同VP2类似，VP3免疫家兔后不产生中和抗体。Ⅱ型的GCRVVP4蛋白均由S6节段编码，是主要的外衣壳蛋白，参与病毒基因组转录过程，并与病毒包涵体的形成有关。有研究表明，将可以表达GCRV VP4蛋白的枯草杆菌芽孢口服疫苗和DNA疫苗免疫草鱼可产生特异性抗体并具有一定的免疫保护作用。Ⅱ型的GCRV VP5 蛋白由S5节段编码，结构中具有一个呼肠孤病毒M2保守结构域，与病毒粒子进入宿主细胞过程有关，具有核苷水解酶活性但抗体无中和活性。VP6蛋白作为GCRV的核心蛋白，能连接内衣壳和外衣壳，具有较好中和活性，口服或注射疫苗均可使鱼体产生特异性抗体，可有效抑制GCRV感染，有研究表明该蛋白与哺乳动物正呼肠孤病毒的δ2蛋白具有较高的相似性。VP7蛋白与不完整的VP5蛋白可以形成异源二聚体，构成GCRV的外衣壳，具有蛋白裂解作用，使用重组VP7蛋白或者DNA疫苗免疫草鱼可以有效抵抗GCRV的感染。

疫苗接种是防治GCRV感染的最有效途径，“草鱼出血病组织匀浆灭活疫苗”虽然有效，但存在灭活不完全导致散毒的风险，并且保护率较低需要反复接种才能获得理想的保护效果。草鱼出血病减毒活疫苗只需要进行一次免疫就能够获得很好的保护效果，但是弱毒疫苗存在毒力返强的风险。此外无论是灭活疫苗还是弱毒疫苗都需要通过注射免疫使草鱼获得保护，操作繁琐，不利于渔业生产中推广使用。

口服疫苗是将抗原等包封或生物载体等技术处理之后，通过投喂含有免疫制剂的饵料，使疫苗进入鱼体的消化道黏膜，通过刺激鱼体肠道黏膜免疫系统来产生免疫应答。鱼类口服接种疫苗不受时间、地点和鱼体大小的限制，适用于大群体接种，操作方便、省时、省力，便于大规模推广应用。但蛋白抗原在水体环境中稳定性差、利用率低，易被消化道内的蛋白酶降解，影响免疫保护效果。因此亟需一种可以有效免疫的口服制剂。

发明内容

本发明的目的在于以乳酸菌模式菌株作为载体，构建可以表达GCRV VP6蛋白的重组乳酸菌。而后经口服灌胃免疫稀有鮈鲫，通过活菌计数确定后肠组织中的重组乳酸菌的驻留情况，通过检测免疫反应相关基因的表达水平、血清特异性抗体水平以及攻毒后对稀有鮈鲫的免疫保护率来评价疫苗的保护效果，以期开发一种安全有效的II型GCRV益生菌口服疫苗，为草鱼的健康养殖提供保障。