[发明专利]一种强化型M-MLV逆转录酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种强化型M‑MLV逆转录酶突变体及其应用，属于生物技术领域。所述M‑MLV逆转录酶突变体是在野生型莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶基础上经人工改造而成，氨基酸序列如Seq ID No.2所示。强化型M‑MLV逆转录酶具备高扩增效率、强抗抑制能力和热稳定性，耐热能力可达到70℃，反应灵敏度高、反应时间快，能够排除RNA样品中所混有的高浓度乙醇或异丙醇的干扰，实现RNA的逆转录。所述增强型逆转录酶突变体可应用于微量病毒RNA逆转录和检测，普通及长链cDNA的快速合成，多种转录组建库等领域，具有广泛的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明涉及一种强化型M-MLV逆转录酶突变体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

RT-PCR技术所使用的模板为单链cDNA或双链DNA，而当检测模板为RNA时，需要用逆转录酶先将RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。莫洛泥鼠白血病病毒(Moloney Murine LeukemiaVirus,M-MLV)逆转录酶是一种以RNA为模板常用的DNA聚合酶，具有RNase H活性，不具有3'-5'外切酶活性，可用于逆转录合成cDNA，但MMLV逆转录酶目前仍存在产量较低，热稳定性差，耐受抑制物能力低，合成速度和灵敏度有待提高等问题，限制了其在微量RNA病毒检测等领域应用。提高核酸诊断方法的效率和准确性是当下研究的重点，所以通过改造逆转录酶来满足高灵敏度、高特异性、低成本、易操作、时间短的需求显得尤为重要。

发明内容

基于上述现有的技术问题，本发明的目的是提供一种强化型M-MLV逆转录酶，是在野生型M-MLV逆转录酶的基础上进行人工改造，得到强抗逆能力、更高的热稳定性以及更快速催化活性的强化型逆转录酶。

本发明的第一个目的是提供一种强化型M-MLV逆转录酶，所述强化型M-MLV逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述的强化型M-MLV逆转录酶的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体，所述载体包含所述的编码所述的强化型M-MLV逆转录酶的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述重组表达载体的出发载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K、pPIC9K系列载体，或pPSUMO。

优选的，所述出发载体为pPSUMO或pET-30a(+)。

本发明的第四个目的是提供一种重组微生物，所述重组微生物表达所述的强化型M-MLV逆转录酶、或包含所述的重组表达载体。

在一种实施方式中，所述重组微生物以大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等为菌株为宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供一种逆转录试剂盒，所述试剂盒含有氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的强化型逆转录酶。

在一种实施方式中，所述制剂和还包括RNase H₂O、逆转录反应缓冲液、dNTPs和逆转录反应引物。

在一种实施方式中，所述逆转录反应缓冲液为5×RT缓冲液；所述dNTPs浓度为10mM；所述RNA酶抑制剂浓度为40U/μL。

在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有RNA酶抑制剂。

本发明的第五个目的是提供一种合成cDNA的方法，所述方法是利用氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的强化型M-MLV逆转录酶或所述逆转录试剂盒将RNA逆转录生成cDNA。

在一种实施方式中，在37℃～70℃下反应不少于1min，再在80～90℃下变性10～20s。