[发明专利]一种裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191的应用

说明书

本发明公开了一种粪肠球菌噬菌体PEf771的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191、其基因克隆纯化方法及其应用，所述粪肠球菌噬菌体裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191克隆自粪肠球菌噬菌体PEf771，裂解酶pEf51氨基酸总数202个，分子大小21.9kDa，蛋白分子式为C₉₇₂H₁₄₉₂N₂₆₀O₃₁₃S₁，等电点4.42；包含12个正电荷残基，25个负电荷残基；不稳定指数为26.84，脂肪系数85.99，总的平均亲水性为(GRAVY)‑0.347，为可溶性蛋白；所述穿孔素pEf191基酸总数107个，相对分子质量12.1kDa，蛋白分子式为C₅₅₀H₈₅₈N₁₄₂O₁₅₅S₆，等电点为8.96；不稳定指数35.1所以该蛋白稳定；脂肪系数为82.90，平均亲水性(GRAVY)‑0.115，为可溶性蛋白；并展开抑菌活性、裂解谱及粪肠球菌生物膜去除研究；通过SD大鼠腹腔感染模型，为进一步研究抗菌的应用范围奠定基础。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种粪肠球菌噬菌体裂解酶和穿孔素蛋白的基因克隆纯化方法及其应用，具体涉及一种粪肠球菌噬菌体PEf771的中的裂解酶pEf51和穿孔素蛋白pEf191的应用。

背景技术

粪肠球菌（ Enterococcus faecalis）又叫做粪链球菌，一种兼性厌氧菌，有圆形、椭圆形两种形态，直径0.5～1.0 μm，菌落形态呈光滑的圆形，颜色灰白，大多数呈短链状或者成对排列，无鞭毛、无芽孢，一般不运动，是自然界中存在比较广泛的一种细菌，也是人类、其他哺乳动物和昆虫胃肠道的共生菌群。作为正常菌群时，对人体或动物往往是有益菌，因为许多粪肠球菌可以产生细菌素或抗生素者等抑菌的成分，能抑制部分有害菌生长；此外，粪肠球菌还能以益生菌成分添加至动物饲料中。但根据世界卫生组织对益生菌的筛选原则和严格定义，只有极少数粪肠球菌属于益生菌，其他大部分均是无用或致病菌。当其出现在水体和土壤等环境时，属于条件致病菌。近年来已逐渐成为人体中感染仅次于葡萄球菌的第二大革兰氏阳性病原菌，当抵抗力较低或者发生异位寄生时，均可能引起严重的细菌性感染。粪肠球菌具有很强的适应和生存能力，并且是医院相关感染中最常分离的物种之一，会引起心内膜炎、菌血症、尿路感染、口腔疾病以及其他致命形式的局部甚至全身感染，严重影响人类生命健康。

粪肠球菌与生物被膜密切相关的毒力因子包括脂磷酸壁、聚合物质、性信息素、细胞溶血素和溶解酶，生物被膜的组成成分主要有EPS（胞外多糖）、胞外蛋白和eDNA（胞外DNA），其形成与表面蛋白（Esp）表达增多相关，它的发展主要分为三个阶段：吸附、成熟、拆卸。形成生物被膜的第一阶段为吸附，细菌能否附着取决于接触面间形成的排斥力小于吸附力、接触面积是否够大，因此该阶段可逆。Esp编码的是粪肠球菌细胞壁上一个表面蛋白，其相对分子质量较大，具有介导细菌间粘附的功能，因此在粪肠球菌生物被膜研究受到广泛关注。据美国国立卫生研究院估计，至少65%的人类感染与生物被膜相关，进一步说明这种生长模式的重要性。群体感应系统(Quorumsensing，QS)是细菌间的一种通信系统，通过分泌和响应化学信号而相互交流，目前研究认为粪肠球菌生物被膜的形成由QS调控，使某些特定基因进行协同表达。粪肠球菌QS中Fsr组分的群体感应依赖性调节系统可通过调控肠球菌表面蛋白（Esp）、明胶酶（GelE）、EbpC、SprE等表达来调节生物膜形成与成熟。据报道，许多肠球菌包括粪肠球菌均具有生物被膜形成能力，食品加工厂中肠球菌生物被膜会污染肉制品表层，这一发现有助于解释为何肠球菌是在肉制品中产生的常见菌种，由于对胞外多糖基质的保护，生物膜包裹的细菌细胞难以消除。