[发明专利]一种等温扩增靶核酸序列的方法

权利要求书

1.一种等温扩增靶核酸序列的方法，其特征在于，所述方法以非疾病的诊断为目的，其包括：

a、设计正向扩增引物F1和F2；其包括：

正向扩增引物F1和F2分别与靶序列T1和靶序列T2配对以延伸扩增，在正向扩增引物F1和F2的5’端分别设计有反向序列RS2和RS1，且所述RS2与所述靶序列T2的SD2序列互补；所述RS1与所述靶序列T1的SD1序列互补；所述SD2和SD1分别位于所述靶序列T2和所述靶序列T1的上游；

b、设计阻滞引物B1和B2；其包括：

在所述SD2和SD1的上游分别设计阻滞引物B2和B1，通过正向扩增引物F1和F2、阻滞引物B1和B2以使得核酸扩增延伸分别在SD1和SD2的下游位置时，延伸结束，完成首轮复制扩增；

c、设计正向扩增引物的剥离引物D1和D2；其包括：

在所述正向扩增引物F1和F2的上游分别设计正向扩增引物的剥离引物D1和D2，用于首轮扩增产物的置换获得首轮扩增产物的单链；

使首轮扩增产物头尾互补杂交后，形成Loop结构，为后续扩增准备模板；

d、根据所述靶序列T1和靶序列T2设计反向扩增引物R1和R2，以所述首轮扩增形成的Loop结构为模板进行扩增；

e、设计反向扩增产物的剥离引物RS1和RS2，将所述步骤d的扩增产物进行置换获得新的单链；使得新的扩增产物头尾互补杂交后，再次形成Loop结构；

f、将所述靶序列T1和靶序列T2以线性的方式或高级结构的方式进行扩增，通过扩增延伸—链置换—Loop形成—扩增延伸的模式，循环往复，使得两个扩增靶序列同步进行核酸扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中用于扩增所采用的酶选自DNA聚合酶和/或逆转录酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中用于扩增所采用的DNA聚合酶选自如下酶中的至少一种：Bst DNA聚合酶，Klenow DNA聚合酶，T4DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，DNA聚合酶I，Vent DNA聚合酶，Phi29 DNA聚合酶，TneDNA聚合酶，Tma DNA聚合酶，PfuDNA聚合酶，KOD DNA聚合酶，Tfl DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，Stoffel片段DNA聚合酶和DEEPVENT DNA聚合酶。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中用于扩增所采用的逆转录酶选自如下酶中的至少一种：

M-MLV逆转录酶，AMV逆转录酶，RSV逆转录酶，RAV逆转录酶，MAV逆转录酶和HIV逆转录酶。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中用于扩增所采用的酶选自：

Bst DNA聚合酶和M-MLV逆转录酶。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中的扩增反应为恒温扩增；

优选地，在55-72℃下扩增；优选地，扩增时间为15-90min。

7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中阻滞引物B1和B2的3’端还设置有封闭基团；

优选地，所述封闭基团选自C3 Spacer，C6 Spacer，C12 Spacer，Spacer18、氨基、双脱氧、碱基倒置、BHQ1、BHQ2和MGB中的任意一种。

8.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述靶基因的数目为2的倍数；

优选地，所述靶基因的数目为2、4或6。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高级结构是指：扩增以二级结构、或以线性结构和二级结构混合的方式进行。

10.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述靶基因的核酸为DNA或RNA。