[发明专利]一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及基因突变检测领域，公开了一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品。所述核酸扩增试剂包括RET M918T反应液，所述反应液中含有用于检测RET基因M918T突变的特异性引物和荧光探针。所述核酸扩增试剂还包括ddPCR Mix。本发明还公开了上述检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒的检测方法的检测方法。本申请的试剂盒采用数字PCR技术，可对甲状腺结节细针穿刺活检样本中的RET基因M918T突变进行定量检测，从而辅助诊断甲状腺结节的良恶性。

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，具体是一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒及其检测方法。

背景技术

RET原癌基因编码一种具有络氨酸激酶活性的单次跨膜糖蛋白受体，作用与神经胶质细胞胞外信号分子。多种肿瘤的发生发展与RET基因异常激活密切相关。其中,RET基因点突变M918T髓质甲状腺癌(MTC)中最常见的突变类型。M918T突变可能导致耐药性，尤其是对血管内皮生长因子抑制剂莫特沙尼的耐药性。并且，RETM918T可能导致更具侵袭性的MTC，预后较差。

RET基因M918T突变检测方法主要包括：①扩增阻滞突变系统法(amplifiedrefractory mutation system，ARMS)；②一代测序法(Sanger sequencing)；③二代测序法(next-generation sequencing，NGS)。ARMS法虽然方便快捷、在临床广泛应用，但只能检测已知突变、且不能定量；一代测序通量小，耗时长；而NGS通量高、可一次性对几百万条至十亿条DNA分子进行并行测序，但对稀有突变及结构变异不敏感且价格昂贵，广泛应用仍受到限制。

数字PCR(Digital PCR)是一种新型的PCR技术，可以同时独立扩增、荧光检测数万个微反应孔。它具有更高的精度、重复性和灵敏度，并且可以定量检测突变基因，适合靶点定量、拷贝数变异(CNV)研究及罕见突变的检测。在临床上，数字PCR能实现绝对定量。这是优于qPCR法的相对定量的。尤其是对于检测低丰度突变样本更具有优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品。所述核酸扩增试剂包括反应液和ddPCRMix。

所述反应液中含有用于检测RET基因M918T突变的特异性引物、野生型荧光探针和突变型荧光探针。所述特异性引物包括一对上游引物和下游引物。所述荧光探针5’端添加荧光报告基团，3’端添加荧光猝灭基团。优选地，所述荧光探针为MGB探针。优选地，所述突变型型荧光探针5’端添加FAM基团，3’端添加MGB基团；所述野生型荧光探针5’端添加VIC基团，3’端添加MGB基团。优选地，所述特异性引物和荧光探针的序列与修饰如下：

上游引物5’-CTCTTTAGGGTCGGATTCCAGTT-3’

下游引物5’-TGCGTGGTGTAGATATGATCAAAA-3’

野生型探针5’-FAM-ATGGATGGCAATTG-MGB-3’

突变型探针5’-VIC-AATGGACGGCAATTG-MGB-3’。

所述反应液中包含的特异性引物含量900nmol/L，荧光探针含量为250nmol/L。

所述ddPCRMix包括反应所需的dNTPs和缓冲液。优选地，所述ddPCR Mix为DropletPCR Supermix。更优选地，Droplet PCR Supermix为2×工作液，配制时加入量为总体系量的一半。