[发明专利]一种I型干扰素受体基因敲除牛肾细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种I型干扰素受体(type I interferon alpha receptor，IFNAR1)基因敲除牛肾细胞系，是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对牛肾细胞进行基因编辑，并经过单克隆挑选而得到。经表型验证表明IFNAR1敲除的牛肾细胞系不表达IFNAR1且感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和3型牛副流感病毒(BPIV‑3)后，病毒滴度均可显著提高，从而可用于牛源病毒临床株的分离鉴定并提高病毒的增殖效率。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种I型干扰素受体(typeⅠinterferon alphareceptor， IFNAR1)敲除的牛肾细胞系，本发明还涉及该细胞系在牛源病毒分离鉴定和复制增殖中的应用及其构建方法。

背景技术

干扰素(Interferon,IFN)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的细胞因子。一般分为三大类：以IFN-α，IFN-β为代表的I型干扰素，以IFN-γ为代表的II型干扰素和以IFN-λ为代表的III型干扰素。有研究表明，IFN-I能抑制I型干扰素信号，促进对持续性感染病毒的控制。干扰素的抗病毒作用是间接地依靠自分泌或旁分泌途径，在病毒感染细胞后，靶细胞会释放出干扰素，释放出的干扰素会与下游细胞表面的IFN受体结合，激活细胞内信号传导途径，并通过活化多条细胞内信号传导通路上的蛋白分子来调节细胞的生长、分化，使得下游细胞免受病毒的感染，从而达到抗病毒的目的，而干扰素本身是不发挥直接“抑杀”或者“中和”病毒的作用的，上述干扰素从产生到影响下游细胞产生抗病毒反应的过程可称为 JAK-STAT信号通路。细胞感染病毒后，在靶细胞中，通过干扰素与下游细胞的干扰素受体结合从而向下游细胞传递信号，基于此，本发明提出通过敲除干扰素受体来阻断或降低 JAK-STAT信号通路，从而增加病毒复制的思路。

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和3型牛副流感病毒(Bovineparainfluenza virus type 3, BPIV-3)牛最常见的致病性病毒，是牛呼吸疾病综合征(Bovine respiratory disease complex, BRD)的主要病毒性病原。其中，BVDV属于黄病毒科、瘟病毒属，与猪瘟病毒及羊边界病病毒具有很高的同源性，有囊膜、球型的单股正链RNA病毒。BVDV除导致BRD外，还可引起牛病毒性腹泻-黏膜病，该病主要以发热、咳嗽、繁殖障碍、免疫抑制造成的呼吸系统和肠道系统疾病、持续感染、血小板减少和出血及致死性粘膜病为临床特征，且呈世界性分布。持续性感染个体症状隐蔽，动物带毒率高，特别是严重影响感染动物的繁殖，是在世界范围内对养牛业造成重大经济损失的疫病之一。但是，BVDV在牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cells,MDBK cells)中的增殖较慢，且病毒滴度较低，给病毒的临床分离和鉴定造成了很大难度。

由成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats, CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)组成的CRISPR/Cas9 系统是第三代人工核酸内切酶，具有构建方法简单快捷、成本低廉、突变效率高、易于实施等优点，已在动植物抗病育种，遗传性状改良，人类遗传病研究等领域得到广泛应用，并引领了基因组工程领域的巨大飞跃，是目前最常用的基因编辑技术。

因此，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将MDBK细胞的IFNAR1基因突变。进一步验证该突变细胞株感染牛源病毒后的病毒增殖效率，为更加高效的分离鉴定牛源病毒提供优良的宿主细胞。

发明内容

本发明目的是针对BVDV在MDBK细胞中增殖慢，病毒滴度低的问题，提供一种基因敲除牛肾细胞系，通过敲除I型干扰素受体提高牛源病毒的增殖效率，使MDBK细胞能更好地应用于牛源病毒的临床分离和鉴定。