[发明专利]快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法

权利要求书

1.一种快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法；其特征在于，包括如下步骤：

（一）芽孢的制备：

a、将活化三代后的B. subtilis 168菌株在LB平板上划线过夜培养至长出单菌落，挑选新鲜的单菌落转接到20 mL LB液体培养基中200 rpm、37℃过夜培养至OD₆₀₀ 为1.2-1.5；

b、将步骤（2）中细菌悬液转接到促芽孢生长培养基DSM中培养20-24h得到芽孢悬液；

c、离心收集步骤b中芽孢悬液，得到未纯化芽孢悬液，用相差显微镜镜检芽孢形态，产芽孢率≥85%；

（二）芽孢纯化：

（1）配备质量分数为65-75%、80-85%、90-95%的蔗糖溶液，分别记为A、B、C溶液；

（2）取20-30mL步骤c中未纯化芽孢悬液离心，用4-6 mL A溶液将芽孢重悬，使得芽孢悬液OD₆₀₀≥ 20，置于冰上10-30 min；

（3）用一次性吸管吸取15-25 mL C溶液加入到50 mL无菌离心管中，防止溶液碰到管壁；

（4）用一次性吸管吸取4-6 mL B溶液，逐滴、缓慢加入到C溶液上表面；

（5）将含有芽孢悬液的A溶液逐滴、缓慢加入到B溶液上表面，加入完后芽孢悬液在B液的上层；

（6）将含有A、B、C三层溶液的离心管放入具有水平转子的冷冻离心机离心；

（7）将离心后的离心管取出置于冰上，可以看到离心管内分为明显的上、中、下三层，用吸管缓慢吸出上、中、下三层中的物质，随后用相差显微镜镜检观察，其中上层为细菌营养体，中层为萌发的芽孢，下层为未萌发芽孢。

2.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：所用枯草芽孢杆菌菌种为Bacillus subtilis 168，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），菌株编号1.1088。

3.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤a中B. subtilis 168菌株的活化方法如下：将新鲜枯草芽孢杆菌菌株B. subtilis 168接种到20 mL LB肉汤培养基中，于37℃、200 rpm培养24 h对菌种进行活化，标记为一代。

4.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤b中将细菌悬液转接到促芽孢生长培养基DSM中在180-200rpm、36-38℃的条件下培养20-24h。

5.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤b中细菌悬液与促芽孢生长培养基DSM的体积比为1:100。

6.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤b中促芽孢生长培养基DSM的制备方法：A液：970 mL去离子水中加入营养肉汤培养基8-12g，质量分数为1.2%MgSO₄溶液8-10 mL、质量分数为10%的KCl溶液8-12 mL、浓度为1 M的 NaOH溶液0.5mL定容至1L，高压灭菌；B液：浓度为1 M的Ca(NO₃)₂ 溶液、浓度为1 M的MnCl₂溶液、浓度为1 M的FeSO₄溶液，通过0.22 μm无菌滤膜除菌；使用时待A液冷却至室温后，分别取1-1.2mL B液中三种组分加入到A液即可。

7.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤c中的离心收集是在6000-8000rpm、3-4℃的条件下离心8-10 min。

8.根据权利要求1所述的快速制备和纯化枯草芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于：步骤（6）中冷冻离心机的离心条件为：3000-5000 rpm，4℃，90-120min。