[发明专利]一种GH16家族热稳定性增强的葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用

说明书

一种GH16家族热稳定性增强的葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用。包括以葡聚糖酶AtGlu16D为母本将Asp219分别突变为Arg219和Ser219后得到突变体AtGlu16D_D219R和AtGlu16D_D219S，突变体AtGlu16D_D219R能够耐受61℃的温度处理，比野生型提高12.5℃。突变体AtGlu16D_D219S能够耐受54.5℃的温度处理，比野生型提高6℃，且均能在偏酸性条件下具有80%以上的酶活力，对GH16家族葡聚糖酶，以及β‑sandwich jelly‑roll结构酶的热稳定性改良，具有重要的指导意义。

技术领域

本发明涉及基因工程、蛋白质工程领域，具体涉及一种GH16家族热稳定性增强的葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用。

背景技术

葡聚糖根据糖苷键的类型分为α-葡聚糖和β-葡聚糖。相比α-葡聚糖，β-葡聚糖具有优良的生化活性和特点。β-葡聚糖又可以根据葡萄糖单体之间的糖苷键的类型细分为谷类和非谷类。水稻、小麦、玉米等农作物中富含β-葡聚糖，并且葡聚糖是我们日常生活中重要的膳食纤维，它通过影响代谢活动来降低胆固醇和血糖。在燕麦和大麦中有一种天然存在的碳水化合物，可溶性 β-1,3-葡聚糖，其具有免疫激活剂的功能，从而可以促进哺乳动物的免疫系统的反应。然而，β-葡聚糖通会增加食糜粘度和影响饲料的消化率，因此β-葡聚糖酶被广泛应用于工业生产中以提高经济效益。

β-葡聚糖酶在我们日常生活中应用广泛，它具有降低人体的胆固醇和血糖的功效，从而促进人体的代谢活动来维持优良的健康水平。由于β-葡聚糖酶可以提高饲料的消化和转化效率，且可以消除饲料中的抗营养因子，其还可被用作补充剂并在饲料行业被使用广泛。β-葡聚糖酶可降低食糜粘度的功效使其在食品制造业也被广泛使用。在目前的工业应用中，影响β-葡聚糖酶普及率的关键因素在于其热环境下的耐受性。目前，基因挖掘和理性设计等方法被应用于筛选获得性质优良的β-葡聚糖酶，且对β-葡聚糖酶的酶学性质的改造也在不断深入。然而，影响β-葡聚糖酶热稳定性的氨基酸位点等关键因素仍不清晰，因此，探究影响β-葡聚糖酶热稳定性的关键因素对拓展其在工业生产中的应用价值具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种GH16家族热稳定性增强的葡聚糖酶突变体及其构建方法与应用，该突变体为定点突变后筛选得到，突变体AtGlu16D_D219R能够耐受61 ℃的温度处理，比野生型（48.5℃）提高12.5 ℃。突变体AtGlu16D_D219S能够耐受54.5 ℃的温度处理，比野生型（48.5 ℃）提高6℃，突变体AtGlu16D_D219R和AtGlu16D_D219S在偏酸性条件下具有80%以上的酶活力。

一种GH16家族热稳定性增强的葡聚糖酶突变体，以AtGlu16D为模板，对其D219位点进行定点突变，获得突变株，所述AtGlu16D的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，

SEQ ID NO.5: