[发明专利]一种检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法

权利要求书

1.一种非诊断目的检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：

S0：构建PRRSV PLP2重组表达质粒，制备PRRSV PLP2重组蛋白；

步骤S0包括以下步骤：

S0-1：准备材料；

S0-2：设计扩增目的基因的PCR引物，以GenBank:EF641008登录的PRRSV JXwn06毒株为模式病原，以pET28a(+)为载体，在PLP2羧基端融合Strep Ⅱ标签蛋白，设计引物并扩增46~323aa PLP2目的基因序列SEQ ID NO.1，设计得到PCR引物，46~323aa PLP2的上游引物：SEQID NO.2；46~323aa PLP2的下游引物：SEQ ID NO.3；

S0-3：PRRSV PLP2蛋白编码基因的扩增，以PRRSV JXwn06感染性cDNA克隆为模板，利用步骤S0-2得到的PCR引物，PCR扩增获得PLP2目的基因片段；

S0-4：将步骤S0-3得到的PCR扩增PLP2目的基因片段进行凝胶回收，得到纯化的PLP2目的基因；

S0-5：构建pET28a(+)-PLP2-Strep Ⅱ 重组表达质粒，使用限制性内切酶Nco Ⅰ、BamH I对pET28a(+)载体进行双酶切，得到酶切产物线性化pET28a(+)载体，将步骤S0-4得到的PLP2-Strep Ⅱ DNA片段与线性化pET28a(+)载体连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，得到pET28a(+)-PLP2-Strep Ⅱ 重组表达质粒；

S0-6：获取PRRSV PLP2重组蛋白，将步骤S0-5得到的pET28a(+)-PLP2-Strep Ⅱ 重组表达质粒转化E.coli BL21感受态细胞，使用LB培养基进行培养和IPTG诱导表达，得到PRRSV PLP2重组蛋白；

S0-7： SDS-PAGE鉴定PRRSV PLP2重组蛋白的表达形式，鉴定出PRRSV PLP2重组蛋白为原核可溶性表达，利用HiCap Streptactin亲和层析柱与Superdex75分子筛纯化，获得纯化的PLP2重组蛋白；

S1：包被PRRSV PLP2重组蛋白，利用包被液将PRRSV PLP2重组蛋白稀释，加入酶标板中，4 ℃包被过夜，其中包被液将PRRSV PLP2重组蛋白稀释为0.4 µg/ml；

S2：洗涤，甩干酶标板中的包被液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；

S3：封闭，将浓度为2% BSA封闭液加入酶标板中，4 ℃封闭10~12 h；

S4：洗涤，甩干酶标板中的封闭液，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；

S5：血清孵育，将猪血清样本用稀释液按1:50稀释，加入酶标板中，37 ℃孵育30 min；

S6：洗涤，甩干酶标板中的血清，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；

S7：酶标二抗孵育，将兔抗猪IgG-HRP抗体用稀释液按1:5000稀释，加入酶标板中，37℃避光孵育30 min；

S8：洗涤，甩干酶标板中的酶标二抗，加入洗涤液，洗涤，洗涤后甩干；

S9：酶标板中加入TMB底物液，室温避光15 min显色；

S10：终止反应，酶标板中加入50 μL浓度为2 mol/L的H₂SO₄终止反应；

S11：读取吸光值，判定检验结果为阴性或阳性，使用酶标仪读取酶标板各孔OD_450nm，当血清样本OD_450nm≥0.27，判定为阳性，反之血清样本OD_450nm＜0.27，判定为阴性；

所述封闭液BSA的溶剂为0.3% PBST溶液；所述包被液为碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为0.1% PBST溶液；所述血清和所述酶标二抗的稀释液为含0.3% PBST的1%BSA溶液。

2. 根据权利要求1所述的非诊断目的检测PRRSV PLP2抗体的间接ELISA方法，其特征在于，步骤S0-1中所述准备材料包括

（1）准备血清，选用PRRSV JXwn06阳性血清、猪瘟病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪流行性腹泻病毒和猪α冠状病毒阳性血清以及SPF猪血清；

（2）选用pET28a(+)载体；

（3）准备试剂，兔抗猪IgG-HRP、山羊抗猪IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-FITC、山羊抗兔IgGFab-FITC和山羊抗猪IgG-FITC，E.coli DH5α感受态细胞、E.coli BL21感受态细胞。