[发明专利]一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法与应用

说明书

本发明适用于生物应用技术领域，提供了一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法，利用鸡TIPE1基因的全长核苷酸序列进行PCR扩增，后利用同源重组技术构建重组表达质粒，经IPTG诱导表达出可溶性重组TIPE1蛋白并进行纯化，随后将蛋白免疫兔子获得抗TIPE1血清。本发明设计方法操作简便，费用成本低，制备出的可溶性蛋白大大缩短了后续纯化的时间，且免疫效果好、抗体效价高。本发明弥补了鸡TIPE1抗体制备及研究的空白，为蛋鸡脂肪肝出血综合征等畜禽代谢性疾病的研究提供了新的思路，具有广泛的推广意义。

技术领域

本发明属于生物应用技术领域，尤其涉及一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法与应用。

背景技术

脂肪肝出血综合征（Fatty liver hemorrhagic syndrome，FLHS）是一种以肝脏和腹腔脂肪积累过多为特征的非传染性疾病，可导致肝脏破裂、出血和猝死。它是世界上最常见的导致蛋鸡死亡的非传染性疾病，严重影响蛋鸡产蛋率，给蛋鸡养殖业造成巨大损失。FLHS多发生于笼养型产蛋鸡，与营养、环境以及遗传等多种因素有关，因鸡只死亡和产蛋下降，造成严重的经济损失。‍在流行病学调查中显示，国内不低于40%的笼养产蛋鸡死亡与FLHS有关，在很多鸡场，FLHS是蛋鸡死淘的主要原因。此外，FLHS与炎症、自噬和凋亡等许多生理过程密切相关。肝脂积累和损伤与肝脏炎症有关，肝脏炎症可导致肝出血，进而诱发FLHS。此外，FLHS可以激活炎症通路或导致肝脏自噬和凋亡的紊乱，进而诱发FLHS。

肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8（Tumor necrosis factor-α-induced protein 8like 1，TIPE1）是肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白8（Tumor necrosis factor-α-inducedprotein 8, TNFAIP8）家族成员之一，已被证实在细胞增殖、凋亡和免疫系统疾病等过程中发挥重要作用。其中，TIPE1对自噬、凋亡和脂质代谢均有显著影响。TIPE1可以通过抑制p53活性或抑制自噬来促进肿瘤的增殖和进展。此外，TIPE家族成员可与PIP2、PIP3、PIP4、PA等脂质分子特异性结合，从而参与脂质和磷信号的调控。TIPE1通过抑制ASK1的多泛素化，抑制肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。因此，根据以往的研究，对TIPE1在各种生理过程中的变化的研究一直是近期研究的重点，TIPE1确实在自噬、免疫、脂质代谢等方面发挥着重要作用。尽管目前的研究发现TIPE1确实参与了脂质代谢的调节，但TIPE1与FLHS的关系尚不清楚，对于鸡TIPE1抗体的研究也尚属空白。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法与应用，旨在解决尽管目前的研究发现TIPE1确实参与了脂质代谢的调节，但TIPE1与FLHS的关系尚不清楚，对于鸡TIPE1抗体的研究也尚属空白的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：以鸡的cDNA为模板，对TIPE1基因进行PCR扩增反应，得到目的片段，用于PCR扩增的引物核苷酸序列为：

F’：GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGACACCTTCAGCACCAA

R’：GCGGCCGCAAGCTTGTCGACAGTATACAACAGGAGGAGGTCG

步骤2：利用步骤1中的目的片段与大肠杆菌表达载体pET-32a(+)应用同源重组的方式进行连接反应，得到重组表达质粒pET-32a-TIPE1；

步骤3：将上述步骤2中的重组表达质粒pET-32a-TIPE1先转入Trelief^TM 5α克隆感受态细胞，再转入BL21(DE3)表达感受态细胞，得到阳性菌落；

步骤4：将上述步骤3中阳性菌落进行培养，将培养后的菌液利用IPTG进行诱导表达（条件：IPTG浓度为0.3 mM ，18℃，18 h，150 rpm/min），经镍柱（Ni-TED）纯化后获得鸡TIPE1重组蛋白（咪唑洗脱浓度：200 mM）；