[发明专利]一种定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法

权利要求书

1.一种定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法，其特征在于，所述工程菌为假单胞菌，该方法通过在工程菌基因组中转入flg22基因来提高植物对根腐病致病菌的抗性；

所述假单胞菌为美国农业研究菌种保藏中心保藏编号为NRRL B-50193的假单胞菌（Pseudomonas sp.）UW4菌株；

改造方法包括如下步骤：

（一）获得flg22基因或者设计含有flg22基因的重组用基因片段

所述flg22基因，碱基序列如SEQ ID No.1所示；

或者设计含有如SEQ ID No.1所示flg22基因的重组用基因片段；

（二）构建含有flg22基因的重组质粒

以在大肠杆菌中外泌性表达flg22基因质粒为载体，重组整合步骤（一）中的flg22基因以获得重组质粒；

（三）三株杂交法构建表达flg22的工程菌

将步骤（二）所构建的重组质粒转化大肠杆菌，筛选转化正确菌株作为供体菌；

将含有结合辅助质粒pRK2013的大肠杆菌作为帮助菌；

以假单胞菌作为受体菌；

三株杂交时：

首先，将供体菌、帮助菌、受体菌分别培养扩增；

随后，按照如下顺序进行菌体杂交：

先将供体菌菌液离心后，收集菌体，并用0.85%的NaCl溶液重悬，加入帮助菌菌液后，再次离心后，收集菌体，并再次用0.85%的NaCl溶液重悬，最后，加入受体菌菌液后，再次离心后，用0.85%的NaCl溶液重悬；

最后，将上述混合菌液滴加平铺于固体培养基表面的硝酸纤维素膜上进行培养，培养完成后用0.85%的NaCl溶液将硝酸纤维素膜上的菌体冲洗下来，稀释后涂布在抗性培养基平板上进行筛选，对筛选所得阳性转化子进行鉴定以获得表达flg22基因的假单胞菌工程菌。

2.如权利要求1所述定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法，其特征在于，步骤（二）中，所述可在大肠杆菌中外泌性表达flg22基因质粒为质粒pBBR1MCS，或者基于质粒pBBR1MCS进一步改造的 pBBR1MCS2。

3.如权利要求1所述定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法，其特征在于，步骤（一）中，所述含有flg22基因的重组用基因片段为flg22-EGFP基因片段；

所述flg22-EGFP基因片段序列如SEQ ID No.2所示。

4.利用权利要求1~3任一项所述定植根尖的防治根腐病的工程菌改造方法改造所得工程菌。

5.权利要求4所述工程菌在小麦根腐病防治中应用，其特征在于，用于防治根腐病致病菌所致根腐病；所述根腐病致病菌为：立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。