[发明专利]以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用

权利要求书

1.一种以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)利用能够表达合成β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以β-吲哚基丙氨酸为底物，生物发酵合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，所述的能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生酶基因包括PCD基因、qBH2产BH4再生酶基因QDPR和BH2产BH4再生酶基因DHFR，PCD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，qBH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQID NO:14所示；

2)从1)的体系中分离得到5-羟基β-吲哚基丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

BH4合成途径关键酶基因FOLE、PTPS、SPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-4所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)为将所构建的重组基因工程菌经过活化培养后，转接至发酵培养基诱导表达后，以β-吲哚基丙氨酸为底物转化生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中将能够表达合成β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌分别经过LB培养基活化培养后，得到种子液，将种子液转接至发酵培养基，发酵后加入IPTG诱导，并加入β-吲哚基丙氨酸，发酵转化生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：种子液OD600＝5；

种子培养基按质量百分比计为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物；种子液的培养条件为28-40℃，160-230rpm；种子液接入发酵培养基的比例为1％-10％；

发酵培养基的组成按质量百分比计为：1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％KH₂PO₄和1.64％K₂HPO₄·3H₂O；

进行诱导前的发酵时间为1-5h；

IPTG的终浓度为0.1-10mM；

诱导表达的条件为16-37℃；

反应体系β-吲哚基丙氨酸浓度为1-50g/L；发酵时间为18-72h。

6.一种以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的工程菌，其特征在于：包含合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因，所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生酶基因，所述的BH4再生酶基因包括PCD基因、qBH2产BH4再生酶基因QDPR和BH2产BH4再生酶基因DHFR，PCD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，qBH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

7.一种权利要求6所述的工程菌的构建方法，其特征在于：β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2，BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR放入同一质粒串连表达；BH4再生酶基因PCD、QDPR、DHFR放入同一质粒串连表达；将上述质粒共同转化至宿主细胞中，得到重组基因工程菌。