[发明专利]一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法

说明书

本发明公开了一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法，首先设计一系列不同浓度梯度的percoll悬液初步将正常密度中性粒细胞及低密度中性粒细胞分离开后，再结合磁珠分选以达到纯化正常密度中性粒细胞和低密度中性粒细胞目的，本发明首次在蜕膜组织中进行不同密度中性粒细胞的分离，快速将蜕膜中的低密度中性粒细胞和正常密度中性粒细胞进行分离纯化，便于研究不同亚群中性粒细胞在早期胚胎发育中的作用。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体是一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法。

背景技术

中性粒细胞是先天免疫系统重要组成部分，约占人类循环白细胞的70％，通过吞噬、产生活性氧、脱颗粒释放杀菌酶以及中性粒细胞胞外诱捕网形成等过程杀灭病原体。在母胎界面，中性粒细胞可以在妊娠前三个月的蜕膜中检测到，妊娠中期逐渐增加。目前有证据证明中性粒细胞有助于受精卵形成和胚胎植入，蜕膜中性粒细胞是妊娠早期和中期组织重塑和胎盘血管形成的关键因素，如异常活化就可能产生很多妊娠并发症，如胚胎种植失败、流产、妊娠期高血压疾病等等。

低密度中性粒细胞，密度低于正常中性粒细胞，具有正常密度中性粒细胞的表型，外周血在密度梯度离心后发现存在于单个核细胞密度层(PBMC)中，是一类异质性很强的细胞。目前对此类细胞的功能也存在争议，部分研究认为低密度中性粒细胞更易活化，可释放更多的炎性细胞因子(TNF-α、INF-γ等)，发挥促炎作用，但另一部分研究确认为这类细胞可抑制T细胞、NK细胞等活性，诱导调节性T细胞生成等发挥免疫抑制作用。

既往文献报道正常密度中性粒细胞及低密度中性粒细胞在早孕期蜕膜就已存在，随着孕周增加，蜕膜免疫细胞中中性粒细胞的含量逐渐增多，但不同中性粒细胞亚群其表面标志物及其作用与外周血中性粒细胞之间是否存在差异尚不清楚，在妊娠中是通过何种方式发挥作用目前也不清楚，通过何种机制导致妊娠并发症也不清楚。故如何成功分离蜕膜中的低密度粒中性细胞及正常密度中性粒细胞，对于我们研究不同密度的中性粒细胞在早期胚胎发育中的行为至关重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法，以至少达到快速分离蜕膜中低密度及正常密度中性粒细胞，以研究不同亚群中性粒细胞在早期胚胎发育中的作用的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法，包括以下步骤：

S1：在术中收集蜕膜组织，在无菌环境下取出蜕膜组织置于添加青链霉素的DMEM高糖培养基中保存；

S2：将所述蜕膜组织置于容器内，使用无菌PBS或生理盐水进行洗涤至所述蜕膜组织无血液残留；

S3：

S31：向所述容器内的蜕膜组织中加入PBS或生理盐水，其后用剪刀将所述蜕膜组织剪碎，其后进行离心处理，并弃上清，得组织碎块；

S32：将所述组织碎块转移至无菌离心管中，并加入含有终浓度为1mg/ml胶原酶Ⅳ和150U/ml DNaseⅠ的DMEM无血清培养基内，其后在37℃水浴震荡条件下消化1h得到细胞悬液；

S33：将所述细胞悬液经细胞筛过滤，其后进行离心处理，并弃上清，得到细胞沉淀A；

S34：若所述细胞沉淀A肉眼可见呈红色，则向所述细胞沉淀A中加入3ml红细胞裂解液吹打，其后置于4℃条件下静置，静置期间吹打混匀两次，其后进行离心处理，并弃上清，得到沉淀细胞B；

S35：使用PBS清洗沉淀细胞B，随后将所述沉淀细胞B置于DMEM培养基中，得到DMEM培养基细胞悬液；