[发明专利]L-苏氨酸醛缩酶突变体R318L/H128N及其应用

说明书

本发明涉及苏氨酸醛缩酶，具体涉及一种L‑苏氨酸醛缩酶突变体R318L/H128N及其应用。所述L‑苏氨酸醛缩酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的L‑苏氨酸醛缩酶的第318位氨基酸由Arg变为Leu以及第128位氨基酸由His变为Asn所得。该突变体在催化3,4‑二羟基苯甲醛和甘氨酸合成屈昔多巴[L‑苏式‑(3,4‑二羟基)苯基丝氨酸]的反应中具有92.89％的非对映选择性，产率达到了1.26mg/mL，在利用表达R318L/H128N的整细胞进行催化时，合成屈昔多巴的非对映选择性为94.5％，产率为1.6mg/mL。整细胞在屈昔多巴的生物合成中具有巨大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及苏氨酸醛缩酶，具体涉及一种L-苏氨酸醛缩酶突变体R318L/H128N及其应用。

背景技术

屈昔多巴(L-threo-DOPS即L-苏式-(3,4-二羟基)苯基丝氨酸)是自1996年米多君获批以来唯一用于治疗帕金森相关神经源体位性低血压(NOH)的药物，用于改善由帕金森病引起的步态僵直和直立性头晕；改善由Shy-Drager综合征或家族性淀粉样神经病所致的直立性低血压、直立性头晕和昏厥；改善血液透析患者由于直立性低血压引发的头晕和乏力。

目前曲昔多巴的合成方法包括化学合成和酶催化法，其工业化生产一直依赖于化学合成。其中，化学合成法主要是通过加成反应、酯化反应和光学拆分来得到手性的屈昔多巴，虽然操作简单，但是反应过程中用到了大量的水、重金属和剧毒的硫化氢，并且光学拆分会导致一半的原料浪费、生产成本高和潜在的环境污染，不符合目前和将来国家提倡和推进的原子经济学和环境保护政策。而酶催化法具有条件温和、用水量少(仅为化学法的十分之一)、没有重金属污染、不使用剧毒化学品、手性选择高等诸多优点，具有很好的应用前景。

苏氨酸醛缩酶有着十分广泛的应用潜力，它可以催化合成手性的医药关键中间体β-羟基-α-氨基酸。根据苏氨酸醛缩酶对底物苏氨酸α碳上的立体专一性可将该酶分为L型和D型两类。申请号为2019109657806，发明名称为“苏氨酸醛缩酶、其编码基因和在屈昔多巴生物合成中的应用”的专利申请公开了一种从黑熊粪便样品中分离的L-苏氨酸醛缩酶基因，全长1032bp，编码由343个氨基酸组成的L-苏氨酸醛缩酶。该酶以3-/4-位羟基取代的苯甲醛和甘氨酸为底物合成屈昔多巴的非对映选择性为30％。较低的非对映选择性大大阻碍了该酶在曲昔多巴合成中的应用。因此，非常有必要挖掘具有高选择性的苏氨酸醛缩酶用于屈昔多巴的合成。

发明内容

对苏氨酸醛缩酶的立体选择性和催化活性具有重要的影响

为了开发具有高选择性的苏氨酸醛缩酶，本发明从一级结构至高级结构多角度多层系比较了从黑熊粪便样品中分离的野生型L-苏氨酸醛缩酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)与同源酶蛋白的异同，在前期确定了影响野生型L-苏氨酸醛缩酶学性质的位点为第318位氨基酸——精氨酸并将该位点的精氨酸(Arg)变为亮氨酸(Leu)的前提下，通过半理性设计和理性设计发掘了具有亚基相互作用的氨基酸His128，将第128位氨基酸由His变为Asn，得到酶突变体，命名为L-TA R318L/H128N突变体。利用分子克隆技术获得了L-TAR318L/H128N突变体的编码基因(SEQ ID NO:4)，通过构建突变体基因的GST融合表达载体并导入基因工程菌E.coli BL21中诱导表达，获得了L-TA R318L/H128N突变体酶蛋白。以L-TA R318L/H128N突变体为催化剂、3-/4-位羟基取代的苯甲醛为底物、甘氨酸为辅底物、5-磷酸吡哆醛为辅酶，在适当的条件和介质内进行酶催化反应，结果表明，该突变体合成屈昔多巴(L-threo-DOPS)的非对映选择性高达92.89％，是野生型的3.09倍，产率达到了1.26mg/mL，在屈昔多巴的工业生产中有巨大的应用价值。

本发明提供一种L-苏氨酸醛缩酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的L-苏氨酸醛缩酶的第318位氨基酸由Arg变为Leu以及第128位氨基酸由His变为Asn所得。