[发明专利]一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒及制备方法和应用

权利要求书

1.一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒，其特征在于：包括可靶向破骨前体细胞的破骨前体细胞膜和包覆于破骨前体细胞膜中的可电荷反转的基因转染材料；所述的可电荷反转基因转染材料由可电荷反转的阳离子聚合物与核酸药物通过静电自组装形成的纳米复合物；该破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒在细胞微环境下实现电荷反转从而释放核酸药物。

2.根据权利要求1所述的一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的可电荷反转的基因转染材料粒径为30～200nm。

3.根据权利要求1所述的一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的核酸药物为siRNA、microRNA或DNA中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

(1)基因转染材料的制备

将B-PDEAEA白色固体溶于10mM的HEPES缓冲溶液，HEPES缓冲溶液的pH为7.4，37℃孵育10分钟，将核酸药物配置成40μg/mL的溶液，将B-PDEAEA用10mM的HEPES缓冲溶液稀释成250～1500μg/mL，HEPES缓冲溶液的pH为7.4，按体积比1:1加入到40μg/mL的核酸药物溶液中，涡旋振荡10～30s，室温静置20～30分钟,得到氮磷摩尔比为5～30的纳米复合物溶液；

(2)提取破骨前体细胞膜

提取哺乳动物单核细胞，15～30ng/mL M-CSF诱导3～5天得到巨噬细胞，再用30～80ng/mL RANKL诱导3～5天，获得破骨前体细胞；洗涤，胰酶消化后，用4℃的TM缓冲液重悬，所述TM缓冲液为1mM MgCl₂和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4；重悬后利用微型注射器挤出30～40次以破坏细胞；

加入1M蔗糖与细胞匀浆混合，达到0.25M蔗糖终浓度；将得到的混合物4℃、2000xg条件下离心10分钟，收集上清液，4℃、3000xg条件下离心30～35分钟，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30～35分钟，得到沉淀即为细胞膜，用10mM HEPES缓冲溶液重悬至1～2mg/mL，HEPES缓冲溶液的pH为7.4；

(3)破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备

将步骤(2)得到的破骨前体细胞膜与步骤(1)得到的可电荷反转的基因转染材料体积比0.5～2混合，优选为0.5～1.5；对混合物超声混合1～3分钟，最后将混合物反复挤压通过聚碳酸酯多孔膜。

5.根据权利要求3所述的一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的氮磷摩尔比为10。

6.根据权利要求3所述的一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的哺乳动物单核细胞为6～8周C57BL/6J小鼠胫骨及股骨单核细胞。

7.根据权利要求3所述的一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的胰酶消化为胰酶消化3～5min后，终止消化并1000rpm，5min离心。

8.根据权利要求3所述的一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的微型注射器为1ml胰岛素注射器。

9.根据权利要求3所述的一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的反复挤压次数为5～20次。

10.根据权利要求3所述的一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的聚碳酸酯的孔径为100～400nm。

11.一种破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒，其特征在于：所述的破骨前体细胞膜仿生纳米颗粒作为转染材料载体或制备靶向药物的应用。