[发明专利]一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法

说明书

本发明公开了一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法，以D‑葡萄糖为原料，使用重组大肠杆菌湿菌体进行全细胞催化反应后制取葡萄糖糖酸和蒜糖醇，其中重组大肠杆菌构建过程包括异源表达葡萄糖异构酶(gi)、D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶(DPEase)、葡萄糖脱氢酶(gdh)与核糖醇脱氢酶(rdh)以及过表达大肠杆菌中的nadE和pncB基因。通过本方法实现了高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇，而且不需要额外添加辅因子。本发明具有制备过程简单、经济成本低、产品转化率高、绿色经济的特点，可用于工业化生产。

技术领域

本发明属于合成生物技术领域，具体涉及一种高效联产蒜糖醇和葡萄糖酸的方法。

背景技术

蒜糖醇(Allitol)，又名阿洛醇，是一种在自然界中天然存在，但含量极少的高值六碳稀有糖醇，具有多种重要生理功能的稀有糖醇。与普通糖醇相比，稀有糖醇具有风味良好、不被人体吸收、抑制血糖提升等特性，使其可广泛应用于食品、农业、医疗等领域。然而目前蒜糖醇在自然界中的含量极低，从植物中提取受季节性因素影响较大，且存在多种结构类似物，高纯度产品的提取成本较高；利用稀有糖D-阿洛酮糖为底物化学合成蒜糖醇受限于原料价格昂贵、副产物繁杂导致分离纯化困难，严重限制了其在上述领域的广泛应用。微生物法生产因其具有绿色、高效、低成本、可连续化生产等优势而受到研究者们的广泛关注，并成功生产出多种食品、医药行业中重要的原料物质。基于微生物发酵法生产蒜糖醇有着广阔的应用前景，有望从根本上解决蒜糖醇的供应不足、价格昂贵等问题。

基于酶转化法利用D-果糖生产蒜糖醇的需要向反应体系中添加昂贵的辅酶 NAD(H)。在宿主内构建多酶表达系统，结合融合蛋白策略，以及发酵条件优化、全细胞催化条件等措施可以以提高蒜糖醇的生产效率，但是以廉价单糖为底物利用胞内级联反应催化生产蒜糖醇的过程存在明显的低效性，且催化终点处有中间产物积累。催化体系效率偏低除受限于多酶体系中各酶性质的较大差异外，蒜糖醇合成过程中辅因子的持续性需求及NAD⁺依赖型甲酸脱氢酶活性较弱，以及因其可能导致的NAD(H)再生能力不足。

葡萄糖酸是葡萄糖的1位的醛基被羧基置换从而形成的醛糖糖酸。葡萄糖酸是化工、医药及食品等产品的重要中间体，可被用来生产葡萄糖酸的衍生物或者直接作为一种产品，可用在乳品工业上防止乳石沉淀、用在食品配方中作为酸味剂等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种高效联产蒜糖醇和葡萄糖酸的方法，利用该方法可以提高蒜糖醇的产率以及同时合成葡萄糖酸。

为解决上述技术发明，本发明的技术方案是：

一种重组大肠杆菌，同时表达葡萄糖异构酶gi基因、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶dpe基因、rdh基因、葡萄糖脱氢酶gdh基因以及过表达NAPRTase和 NAD+Syn的编码基因pncB和nadE。

所述gi基因来源于Bacillus sp.的葡萄糖异构酶基因gi。

所述的重组大肠杆菌构建按以下操作进行：将来源于Bacillus sp.的葡萄糖异构酶基因gi以及来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的D-阿洛酮糖-3- 差向异构酶基因dpe连接在pRSFDuet-1上，得到重组质粒pRSFDuet-gi-dpe；将来源于Providenciaalcalifaciens的rdh基因片段以及来源于枯草WB800的 gdh基因片段其连接在pETDuet-1表达载体得到质粒pETDuet-gdh-rdh；再将重组质粒pRSFDuet-gi-dpe和上述重组质粒pETDuet-gdh-rdh转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌Ec/pRgd-pEgr；在上述重组大肠杆菌 Ec/pRgd-pEgr的基础上，过表达大肠杆菌中的NAPRTase和NAD⁺Syn的编码基因pncB和nadE。

所述的重组大肠杆菌在制备蒜糖醇或葡萄糖酸上的应用。